[发明专利]评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因及其表达载体和应用

说明书

本发明涉及评估USH2A外显子13剔除效率的MINI‑REP基因及其表达载体和应用，涉及基因工程技术领域。该MINI‑REP基因包括报告基因和小基因，所述报告基因为行使报告功能的基因，所述小基因包括依次连接的USH2A内含子12、外显子13和内含子13的基因；所述小基因插入所述报告基因，将所述报告基因分割成断裂报告基因，所述断裂报告基因单独表达均不发挥报告功能，串联完整表达则发挥报告功能。所述MINI‑REP基因可应用于现有技术中所有用于诱导USH2A外显子13剔除的相关技术的效率评估，可用于新型技术的研发、效果检测盒高效筛选，可用于USH2A外显子13剔除效率的快速、直观、高效、高灵敏度的定性和定量分析。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及评估USH2A外显子13剔除效率的MINI-REP基因及其表达载体和应用。

背景技术

Usher综合征(Usher Syndrome)是一类遗传性疾病，又称耳聋-色素性视网膜炎综合征，其特征是不同程度的先天性感音神经性耳聋，以及色素性视网膜炎(RP)引起的进行性视力丧失。在临床上Usher综合征可分为3种类型：1、Ⅰ型Usher综合征，患者表现出先天性重深度感音神经性耳聋，前庭反应消失，青春期前出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为MYO7A、CDH23、USH1C、PCHD15等；2、Ⅱ型Usher综合征，患者表现出先天性中重度感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为USH2A、GPR98、WHRN等；3、Ⅲ型Usher综合征，患者表现出进行性感音神经性耳聋，前庭反应正常，青春期末出现色素性视网膜炎，逐渐致盲，其关联基因为CLRN1等。

其中，II型占Usher综合症的比例超过50％。而USH2A基因突变是Usher综合征II型的最常见原因，涵盖超过50％的Usher综合征患者。同时，USH2A基因的突变也是导致非综合征性视网膜色素变性(NSRP)的重要原因之一。

USH2A定位于1q41，其在基因组中的跨度超过800kb，编码一个大型跨膜蛋白Usherin，其锚定在视网膜感光细胞和内耳毛细胞的质膜上，是纤毛发育和维持必不可少的组分。在视网膜中，Usherin是USH2复合物的重要部分，被认为在稳定光感受器的外节段发挥作用。USH2A具有2个亚型，在视网膜细胞中主要的亚型含有72个Exon，编码区长度约为15.6kb。Usherin蛋白的胞外部分包含许多重复的结构域，包括10个Laminin EGF-like(LE)结构域和35个Fibronectin type 3(FN3)结构域。人USH2A外显子13长度为642bp，编码着第723～936位氨基酸，为Usherin蛋白中10个LE结构域中的4个。

USH2A基因的第13号外显子13、第50号外显子和第40号内含子的突变会引发Usher综合征。迄今为止已经鉴定出超过1000个分布在整个USH2A基因中的致病性突变，其中的外显子13是USH2A基因中突变最频繁的外显子，约占35％。USH2A基因第13号外显子的突变，包括c.2802TG(p.Cys934Trp，中国患者频率最高突变)、c.2299delG(p.E767SfsX21，欧美患者频率最高突变)、c.2276GT(氨基酸变化:p.C759F)、c.2522CA(p.S841Y)、c.2242CT(p.Gln748X)、c.2541CA(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776CT(p.R926C)、c.2209CT、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431AT、c.2431_2432delAA、c.2440CT、c.2525dup、c.2610CA、c.2755CT、c.2176TC、c.2236CG、c.2296TC、c.2332GT。