[发明专利]一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒

说明书

本发明属于基因突变检测技术领域，公开了一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。本申请的技术方式是采用多重PCR扩增子建库技术，对肥厚型心肌病检出率最高的5个致病基因MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1突变进行捕获建库，捕获区域包括5个基因的全部外显子区域及其上下游各20bp碱基序列，能够兼容于多种测序平台，同时具有建库步骤简洁、成本节约、应用范围广和显著降低了检测数据量等诸多优势。

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。

背景技术

肥厚型心肌病HCM是一种以心肌肥厚为特征的心肌疾病，主要表现为左心室壁增厚，通常指二维超声心动图测量的室间隔或左心室壁厚度≥15mm,或者有明确家族史者厚度≥13mm，通常不伴有左心室腔的扩大，需排除负荷增加如高血压、主动脉瓣狭窄和先天性主动脉瓣下隔膜等引起的左心室壁增厚。HCM全世界患病率约为1/500，中国患病率80/10万，粗略估算中国成人HCM患者超过100万。HCM是青少年和运动员猝死的主要原因之一。

绝大部分HCM呈常染色体显性遗传，约60％的成年HCM患者可检测到明确的致病基因突变，目前已发现27个致病基因与HCM有关，其中大部分突变集中在肌小节蛋白编码基因上，包括粗肌丝，中间丝，细肌丝，等。其中，粗肌丝肌球蛋白重链7(MYH7)基因在临床诊断为HCM患者中检出频率为15～30％，中间丝心脏型肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)约15～30％，细肌丝心肌肌钙蛋白T2(TNNT2)在HCM患者中检出率为1～5％，细肌丝心肌肌钙蛋白I3(TNNI3)在HCM患者中检出率为1～5％，细肌丝原肌球蛋白1(TPM1)在HCM患者中检出率为1～5％。

目前普遍应用的肥厚型心肌病检测方法主要为全外显子测序和液相捕获测序法。这两种方法均为探针捕获建库与二代测序结合的方法，该方法存在以下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、GC富集区的存在等问题，难以满足临床检测要求。

目前也有已公开专利利用PCR方法来检测肥厚型心肌病基因突变，但是该专利所用的多重PCR为LMPCR，但是该专利所用的LMPCR在进行PCR反应之前，依然需要常规二代测序的超声打断，杂交捕获进行文库制备，依然存在有杂交捕获建库的缺点，因此在使用上具有较大局限性。

因此，本领域需要可用于高灵敏度、高通量、低成本检测肥厚型心肌病相关基因突变的方法和试剂盒。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：

S1、第一轮多重PCR反应：包括T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系；T1反应管体系包括第一引物池和第一反应液；T2反应管体系包括第二引物池和第二反应液；T3反应管体系包括第三引物池和第三反应液；

所述第一引物池包括58对引物，58对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.1-SEQ ID NO.116所示；

所述第二引物池包括57对引物，57对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.117-SEQ ID NO.230所示；

所述第三引物池包括3对引物，3对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.231-SEQ ID NO.236所示；

S2、多重PCR反应合并：选取T1反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物A；T2反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物B；选取T3反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物C；将上述反应产物A、反应产物B与反应产物C混合合并，获得合并产物；

S3、磁珠纯化合并产物；