[发明专利]高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体及其应用

说明书

本发明涉及高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体及其应用。所述突变体为肝素骨架合酶PmHS2的第130位丝氨酸、第135位丝氨酸、第197位苯丙氨酸、第326位苏氨酸、第344位苏氨酸、第476位异亮氨酸中任意一个位点突变。本发明提供的肝素骨架合酶PmHS2突变体具有良好的稳定性，在37℃放置72h后仍能保持40％以上的酶活性，是现有肝素骨架合酶PmHS2的2倍以上。特别是肝素骨架合酶突变体PmHS2(F197Y)、肝素骨架合酶突变体PmHS2(S135A)和肝素骨架合酶突变体PmHS2(T344S)所表达的蛋白，在37℃放置72h后仍能保持80％以上的酶活性，是现有肝素骨架合酶PmHS2的5～7倍。

技术领域

本发明涉及高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是一种结构复杂的生物大分子，由己糖醛酸或己糖和己糖胺组成的重复二糖单元，有规则的排列而形成的一种线性无分支的酸性多糖。糖胺聚糖分布广泛且种类繁多，根据硫酸化程度分为无硫酸修饰的糖胺聚糖和硫酸修饰的糖胺聚糖，无硫酸修饰的糖胺聚糖只有透明质酸一种，而硫酸修饰的糖胺聚糖包括硫酸皮肤素/硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素等。

肝素(Heparin，简称HP)，是一种重要的糖胺聚糖，是由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。它因首先从肝脏中发现而得名，肝素具有增强天然丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ的活性，催化抑制内源性凝血途径的所有丝氨酸蛋白酶，因此具有抗凝血抗血栓的作用，也可以通过结合其他蛋白质来介导各种重要的生理过程，包括细胞粘附、脂质代谢和生长因子调节。临床上还可用于治疗心绞痛、肾病综合征、严重烧伤、类风湿性关节炎等，其需求量在国际上常年处于生物技术药物领域的前列。

肝素的来源主要分为动物提取、化学合成和化学酶法合成。动物提取肝素主要是从猪和牛的小肠粘膜中提取，但由于提取方法的差异以及动物体来源的肝素的基本单元的结构，数目各不相同，导致肝素产物的结构、构型、分子量各有异同，可能引发肝素污染。此外，肝素的结构较为复杂，使用化学合成的方法延长糖链时要考虑对不稳定基团进行保护、去保护、活化和偶联等步骤，而且还要考虑区域选择性和立体选择性等情况，难度较大且产率低。HP的化学酶法合成是化学法和酶法相结合的方法，合成过程所需的酶反应条件温和，特异性强。相对于化学合成来说，该方法步骤简单，效率高。目前化学酶法合成肝素骨架糖链常用的酶有肝素骨架合酶KfiA和肝素骨架合酶PmHS2，其中肝素骨架合酶PmHS2是具有N-乙酰氨基葡糖转移酶活性和葡萄糖醛酸转移酶活性的双功能酶，在化学酶法合成中应用广泛，提高该酶的活性将有助于高效合成肝素骨架糖链。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体及其应用。

术语说明：

GlcA-pNP：中文全称为4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸，其作用是作为肝素寡糖合成的起始受体底物；

UDP-GlcNAc：中文全称为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，其作用是作为供体，为肝素寡糖的合成提供乙酰葡萄糖胺；

本发明技术方案如下：

高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体，所述突变体为肝素骨架合酶PmHS2的第130位丝氨酸、第135位丝氨酸、第197位苯丙氨酸、第326位苏氨酸、第344位苏氨酸、第476位异亮氨酸中任意一个位点突变。

根据本发明优选的，所述突变体为肝素骨架合酶PmHS2突变体(S130T)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；是将肝素骨架合酶PmHS2氨基酸序列的第130位丝氨酸突变成苏氨酸。