[发明专利]一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法

说明书

本发明公开了一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，属于食品安全检测技术领域。通过纳米可控自组装制备基于非酶杂交的上转换纳米荧光探针和超结构氮化碳比色探针，结合标准曲线法构建高灵敏特异性致病菌检测体系，实现食品中食源性致病菌的低成本、高灵敏和特异性检测。

技术领域

本发明具体涉及一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

根据世界卫生组织公告，食源性致病菌是引发食品卫生问题的重要原因之一。食品中常见的食源性致病菌包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李食堂菌等，其传统的检测方法有微生物检验法、分子生物学法和酶联免疫吸附法(ELISA)等，仪器设备昂贵、检测成本高、步骤繁琐，不能满足致病菌的实时快速检测要求。本发明提出了一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，克服传统方法的不足，提高食品中食源性致病菌检测的速度和准确性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测技术中存在的技术缺陷，如：检测成本高、检测时间长、检测步骤繁琐等，本发明提供了一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，通过纳米可控自组装制备基于非酶杂交的上转换纳米荧光探针和超结构氮化碳比色探针，结合标准曲线法构建高灵敏特异性致病菌检测体系，实现食品中食源性致病菌的低成本、高灵敏和特异性检测。

具体的，本发明采取的技术方案是：一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一，油酸涂层化铒基上转换纳米颗粒制备(OA-UCNPs_(Er))：将一定质量的YCl₃·6H₂O、YbCl₃·6H₂O和ErCl₃·6H₂O分散在甲醇溶液中，然后将均匀的混合液转移至三口烧瓶中，接着加入C₁₈H₃₄O₂和C₁₈H₃₆，上述混合液在氮气环境下进行持续搅拌，接着，将温度升至100℃以上保持一定时间后降温至室温，然后逐滴加入NH₄F和NaOH混合甲醇分散液；接着在梯度升温直到甲醇挥发掉；然后继续在氮气环境下加热搅拌，最终得到OA-UCNPs_(Er)。

步骤二，羧基修饰的上转换纳米颗粒制备(UCNPs-COOH)：采用配体交换法利用氯仿和甲苯混合聚丙烯酸，加入到OA-UCNPs_(Er)溶液中搅拌过夜后离心得到UCNPs-COOH；

步骤三，UCNPs-COOH的表面发夹结构探针修饰(UCNPs-H1和UCNPs-H2)：将氨基修饰的两个发夹探针H1和H2通过酰胺缩合反应进行连接，具体为将UCNPs-COOH和NHS以及EDC在冰水浴中混合搅拌，然后进行离心清洗，接着加入H1溶液进行反应，最后离心得到UCNPs-H1；UCNPs-H2的制备步骤同上。

步骤四，荧光比色传感体系的构建：首先将致病菌的特异性适配体和其对应的半互补链进行杂交反应得到半双链结构，然后加入C₃N₄、UCNPs-H1和UCNPs-H2，即为最终建成体系；

步骤五,食源性致病检测方法建立：在检测体系中分别加入不同浓度的致病菌溶液，体系混合后，接着加入TMB和H₂O₂进行催化显色反应，然后进行荧光信号采集，利用标准曲线法建立定量模型；

进一步，步骤五中还包括，将二维纳米材料C₃N₄的催化比色性能、DNA自组装特性以及上转换纳米荧光稳定的发光特点进行了结合，能够提高检测的灵敏度。