[发明专利]一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法

权利要求书

1.一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，油酸涂层化铒基上转换纳米颗粒制备OA-UCNPs_(Er)：将一定质量的YCl₃·6H₂O、YbCl₃·6H₂O和ErCl₃·6H₂O分散在甲醇溶液中，然后将均匀的混合液转移至三口烧瓶中，接着加入C₁₈H₃₄O₂和C₁₈H₃₆，上述混合液在氮气环境下进行持续搅拌，接着，将温度升至100℃以上保持一定时间后降温至室温，然后逐滴加入NH₄F和NaOH混合甲醇分散液；接着在梯度升温直到甲醇挥发掉；然后继续在氮气环境下加热搅拌，最终得到OA-UCNPs_(Er)；

步骤一中，YCl₃·6H₂O、YbCl₃·6H₂O和ErCl₃·6H₂O的质量比例范围为：(2-20):(1-4):(0.1-0.4)；C₁₈H₃₄O₂和C₁₈H₃₆的用量范围为：(1-5):(3-8)；NH₄F和NaOH的用量范围为(2-6):(4-8)；

步骤二，羧基修饰的上转换纳米颗粒制备UCNPs-COOH：采用配体交换法利用氯仿和甲苯混合聚丙烯酸，加入到OA-UCNPs_(Er)溶液中搅拌过夜后离心得到UCNPs-COOH；

步骤二中，加入氯仿和甲苯体积范围为2:3,聚丙烯酸质量范围为1-100mg；

步骤三，UCNPs-COOH的表面发夹结构探针修饰UCNPs-H1和UCNPs-H2：将氨基修饰的两个发夹探针H1和H2通过酰胺缩合反应进行连接，具体为将UCNPs-COOH和NHS以及EDC在冰水浴中混合搅拌，然后进行离心清洗，接着加入H1溶液进行反应，最后离心得到UCNPs-H1；UCNPs-H2的制备步骤同上；

步骤三中，UCNPs-COOH和NHS以及EDC的用量比例范围为(1-2):(1-3):(0.1-2)；H1和H2的用量范围为1-500μL；

步骤四，荧光比色传感体系的构建：首先将致病菌的特异性适配体和其对应的半互补链进行杂交反应得到半双链结构，然后加入C₃N₄、UCNPs-H1和UCNPs-H2，即为最终建成体系；

步骤四中，所加入的C₃N₄、UCNPs-H1和UCNPs-H2比例范围为1:5:5；

步骤五,食源性致病检测方法建立：在检测体系中分别加入不同浓度的致病菌溶液，体系混合后，接着加入TMB和H₂O₂进行催化显色反应，然后进行荧光信号采集，利用标准曲线法建立定量模型。

2.根据权利要求1所述的一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，其特征在于，步骤五中还包括，将二维纳米材料C₃N₄的催化比色性能、DNA自组装特性以及上转换纳米荧光稳定的发光特点进行了结合，提高检测的灵敏度。

3.根据权利要求1所述的一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，其特征在于，所述UCNPs-H1和UCNPs-H2既能够作为荧光信号探针，也作为能够影响C₃N₄催化比色性能的触发元件。

4.根据权利要求1所述的一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，其特征在于，步骤五中，所加入的TMB和H₂O₂的比例为(1-10):(0.1-2)。