[发明专利]一种双靶点mRNA疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种双靶点mRNA疫苗，其特征在于：包括脂质体混合物和双靶点mRNA；所述脂质体混合物，包括DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇、PEG200-DMG，摩尔比为50 : 10 : 37.5 : 2.5；

所述双靶点mRNA由线性化的重组质粒转录得到；所述重组质粒包含目的基因片段；所述目的基因片段由以下模块依次串联得到：5′–UTR核酸人工序列、P53核酸人工序列、Linker核酸人工序列、Kras核酸人工序列、MITD核酸人工序列、3′–UTR核酸人工序列；所述5′–UTR核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述P53核酸人工序列如序列表中SEQID NO.2所示；所述Linker核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述Kras核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述MITD核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述3′–UTR核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

2.制备权利要求1所述双靶点mRNA疫苗的方法，其特征在于：所述方法包括目的基因片段的构建、重组质粒的构建、重组质粒线性化酶切及回收、转录获得mRNA、包装mRNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组质粒的构建，将目的基因片段克隆到PVAX1载体上，得到重组质粒；所述转录获得mRNA，转录合成5′加帽，3′端加Poly(A)尾的mRNA。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述包装mRNA为采用脂质体混合物包载mRNA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述包装mRNA具体包括：脂质体混合物的乙醇溶液的制备、mRNA水溶液的制备、合成LNP/mRNA疫苗颗粒、制得疫苗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述脂质体混合物的乙醇溶液的制备：将脂质体混合物溶于乙醇中，得到脂质体混合物的乙醇溶液，所述脂质体混合物与乙醇的质量体积比为16.1-16.2mg：1mL；

所述mRNA水溶液的制备：将转录得到的mRNA，溶解在柠檬酸缓冲液中，吹打分散，加入PBS，充分混匀，得到mRNA水溶液；所述mRNA与柠檬酸缓冲液、PBS的质量体积比为：0.4-3.2μg：1mL：2mL；

所述合成LNP/mRNA疫苗颗粒，使用纳米颗粒合成系统，将脂质体混合物的乙醇溶液与mRNA水溶液以1:3的体积比，合成LNP/mRNA疫苗颗粒；

所述制得疫苗，将LNP/mRNA疫苗颗粒在PBS溶液中透析24h，浓缩、过滤得到疫苗。