[发明专利]一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，涉及细胞纯化的技术领域。其提取纯化方法，包括以下步骤：S1、粗提小鼠脑组织中的脑微血管内皮细胞；S2、对S1处理后的脑微血管内皮细胞混合物进行第一次CD31免疫磁珠分选以纯化；S3、对S2处理后的脑微血管内皮细胞进行第二次CD31免疫磁珠分选以纯化，即得纯化后的脑微血管内皮细胞。本申请采用CD31磁珠二次分选的方式，降低对脑微血管内皮细胞活性的损伤，分离纯化效率高，操作步骤相对简单，可以获得高纯度、高产量及高活性的脑微血管内皮细胞。

技术领域

本发明涉及细胞提取的技术领域，尤其涉及一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法。

背景技术

脑微血管内皮细胞(Brainmicrovascularendothelialcells)，简称BMECs，是构成血脑屏障的主要成分，是各种生理、病理因素作用的靶细胞，可以通过选择性双向跨细胞膜转运系统以及细胞间的紧密连接将脑组织与血液分开，限制大多数极性分子和蛋白质进入脑组织。其培养精于20世纪70年代末，也是研究血-脑屏障及脑神经科多种疾病的一个重要模型，分离纯化BMECs为研究脑内皮细胞的生理和病理特性提供了有效的技术支持。BMECs细胞具有很多自身特性，如细胞活性低，分离的细胞容易受到成纤维细胞、平滑肌等杂细胞污染等等问题导致产量低，BMECs的分离培养，关键在于脑微血管段的分离和内皮细胞的获取、纯化。

目前应用的方法主要有非酶法和酶消化法两种，非酶法应用较多的主要有：采用匀浆器匀浆或直接将组织切碎至1～2mm。酶消化法中BMECs大多是在剪碎或使其匀浆化后与蛋白水解酶共培养不同的时间(酶消化法)后分离出来。目前这些方法存在着微血管活性损伤的问题，此外，提取步骤繁琐、费时、费力，分离的细胞容易受到成纤维细胞、平滑肌等杂细胞污染等等问题导致产量低，不能够有效获得高产量、高纯度及高活力的BMECs。

发明内容

本发明提供了一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，为了解决目前的纯化技术存在产量低、活性和纯度低的缺陷，发明人通过反复试验和改进，采用CD31免疫磁珠多次分选的方式，降低对脑微血管内皮细胞的活性影响，分离效率高，成功摸索得到相对简单，且高产量、高纯度及高活力的纯化方法，具有稳定的可重复性。

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，具体包括以下步骤：

S1、粗提小鼠脑组织中的脑微血管内皮细胞；

S2、对S1处理后的脑微血管内皮细胞混合物进行第一次CD31免疫磁珠分选以纯化；

S3、对S2处理后的脑微血管内皮细胞进行第二次CD31免疫磁珠分选以纯化，即得纯化后的脑微血管内皮细胞。

通过采用上述方案，将采用CD31免疫磁珠结合脑微血管内皮细胞进行二次分选，使脑微血管内皮细胞与杂质细胞或组织相互分离，操作步骤相对简单，不需要对CD31免疫磁珠进行洗脱工序，降低了纯化过程中对脑微血管内皮细胞的机械损伤和活性损伤，分离效率高，可以获得高纯度、高活性和高产量的脑微血管内皮细胞。

作为优选方案，在所述S2中，对S1处理后的脑微血管内皮细胞混合物进行第一次CD31免疫磁珠分选，随后贴壁培养；在所述S3中，收集贴壁培养后脑微血管内皮细胞进行第二次CD31免疫磁珠分选，随后贴壁培养，即得纯化后的脑微血管内皮细胞。

作为优选方案，在所述S3中，对所述纯化后的脑微血管内皮细胞进行DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1双吞噬实验、血管生成实验和免疫荧光染色实验以鉴定脑微血管内皮细胞。

作为优选方案，在所述S2中，具体包括以下步骤：

S201、加入ECM培养基于S1粗提的脑微血管内皮细胞混合物中重悬细胞，加入CD31免疫磁珠，移入EP管，置于4℃摇床中结合；