[发明专利]一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法

权利要求书

1.一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、粗提小鼠脑组织中的脑微血管内皮细胞；

S2、对S1处理后的脑微血管内皮细胞混合物进行第一次CD31免疫磁珠分选以纯化，随后贴壁培养；

S3、对S2处理后的脑微血管内皮细胞进行第二次CD31免疫磁珠分选以纯化，随后贴壁培养，即得纯化后的脑微血管内皮细胞；

在所述S2中，具体包括以下步骤：

S201、加入ECM培养基于S1粗提的脑微血管内皮细胞混合物中重悬细胞，加入CD31免疫磁珠，所述CD31免疫磁珠的添加量为25μL磁珠/10⁸个细胞，移入EP管，置于4℃摇床中结合；

S202、吸弃上清，加入ECM培养基重悬细胞，接种于预先使用Ⅰ型胶原包被过的细胞培养板中，置于37℃二氧化碳细胞培养箱孵育；

S203、隔天使用F12培养基冲洗细胞，以除去组织和细胞碎片，加入ECM培养基，继续培养；

在所述S3中，具体包括以下步骤：

S301、将所述S2处理后的脑微血管内皮细胞培养到细胞密度达80％，胰酶消化后用ECM培养基洗涤细胞；

S302、对所述S301处理收集的脑微血管内皮细胞进行第二次CD31磁珠分选，所述第二次CD31磁珠分选的步骤与S2中第一次CD31磁珠分选的步骤和参数控制相同，继续培养后即得纯化的脑微血管内皮细胞；

所述ECM培养基具体包括以下成分：肝素：0.5v％；谷氨酰胺：1v％；100x青-链霉素：1v％；FBS：10v％；内皮细胞生长补充物：0.03w/v％；F12培养基：余量。

2.如权利要求1所述的一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，其特征在于，在所述S3中，对所述纯化后的脑微血管内皮细胞进行DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1双吞噬实验、血管生成实验和免疫荧光染色实验以鉴定脑微血管内皮细胞。

3.如权利要求1所述的一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，其特征在于，在所述S1中，具体包括以下步骤：

S101、消毒小鼠头部后断头取脑，置于装有预冷的Hank’s液的10cm培养皿中，以Hank’s液冲洗脑组织，随后将脑组织切成小块；

S102、加入IMDM培养基于所述脑组织中，离心后弃去上清液，并向脑组织沉淀物中加入蛋白水解酶，放入37℃培养箱中孵育；

S103、孵育结束后，转移至培养皿中研磨，使脑组织悬液呈粉红色匀浆；

S104、在所述脑组织悬液中加入22％BSA，混匀后离心，离心后吸出上层的髓鞘组织和中层的BSA，即得下层的微血管段和脑微血管内皮细胞沉淀；

S105、以ECM培养基重悬所述微血管段和脑微血管内皮细胞沉淀，再加入ECM离心和洗涤，得到粗提处理的脑微血管内皮细胞混合物。

4.如权利要求3所述的一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，其特征在于，在所述S103中，采用19号针头对所述脑组织研磨5-7次，随后用21号针头进一步研磨，在每一次研磨操作时将所述脑组织悬液完全吸入再完全挤出。

5.如权利要求3所述的一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，其特征在于，所述蛋白水解酶为木瓜蛋白酶。