[发明专利]基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，利用覆盖宿主全基因组的sgRNA库，与带标签的dCas9蛋白孵育组装，获得dCas9‑sgRNA复合物，再与待测宿主样本DNA孵育，利用亲和磁珠或树脂特异性捕获带对应标签的dCas9‑sgRNA‑宿主DNA复合物，从而将宿主基因组DNA与病原微生物DNA分离。本发明方法使用范围更广、灵敏度更高、安全性更好、效率更高、偏好性更小、操作更简单、耗时更短。本发明方法不需要复杂的提取分离操作，也不需要保留病理样本中细胞的完整性，能够适用于各类经医学处理的病理样本。既减少了病理样本储存和处理的难度和成本，也极大增强了病理样本储存和处理的安全性。

技术领域

本发明专利涉及一种基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，属于生物技术领域。

背景技术

病原微生物检测是疾病诊断领域的重要项目，基于RT-qPCR或者分子标志物的传统检测方法只能检测某一个或者某一类病原微生物，无法对于未知病原或未知病症进行有效的诊断。随着肠道微生物和病原微生物领域的兴起，许多疾病或症状是多种微生物共同作用的结果。因此，高通量基因组学技术和高通量转录组学技术被用于系统鉴定病理学样本中的微生物种类，为病原微生物致使疾病的诊断提供了强大的诊断工具，被称为宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generation sequencing,mNGS)。但是，病理样本中通常含有大量的病人自身的细胞和核酸(高达90-99％)，这极大地占据了测序的数据，使得有效数据的占比只有不到10％。这不仅提高了测序的数据量和测序成本，也降低了病原微生物检出的效率和准确性。因此，开发一种能够有效靶向去除人类自身DNA或者RNA的技术，对于提高病理样本中致病微生物的检出效率，降低检测成本，具有重要的意义。

目前市面上主要还是利用差异裂解法来去除宿主基因组，其主要原理是利用细菌通常具有细胞壁，因此可以承受较为剧烈的裂解条件，从而达到针对性裂解宿主细胞的目的。宿主细胞裂解后可以通过核酸酶消解去除宿主核酸，完整的细菌和真菌随后被分离以及进一步核酸提取。但是，这种差异裂解法对宿主基因组的去除效率低，对微生物核酸的保留也不完整。而且反复的洗涤过程会导致大量的损失。这些导致回收的微生物损失严重，且具有严重的偏好性(越难被裂解和越容易回收的微生物保留越完整，如革兰氏阳性菌)。这些导致利用差异裂解法进行mNGS检测具有严重的偏好性和较大的微生物种类损失，阻碍了mNGS在致病微生物诊断领域的应用。很多病理学样本在取样和储存过程中就会造成病原微生物细胞破裂(如高温灭活处理和低温冷藏等)，这些样本无法使用差异裂解法来进行病原微生物核酸富集，影响了病原微生物的检测精确性。此外，因为病理学样本具有较强的传染性和致病性，因此在分离过程中需要在指定要求的生物安全柜和高生物安全等级的实验室中进行，这既增加了病原微生物分离的难度和成本，也给操作人员的安全带来了隐患。而且，对于寄生于宿主细胞内部的病毒类病原微生物，无法使用差异裂解法进行病毒核酸的富集。因此，开发更加高效便捷且安全的宿主基因组去除技术，对于病原微生物检测领域，具有重要的价值和作用。

CRISPR/Cas9基因编辑系统从被开发出来就一直受到基因诊断和治疗领域的重点关注。相较于传统的基因编辑技术，CRISPR技术具有编辑效率高、特异性高、操作简单等优点。因此，CRISPR技术在生命科学和医疗领域收到了广泛的应用和改进，包括CRISPR/dCas9系统、CRISPR/Cas12系统、CRISPR/Cas13系统等工具。CRISPR/dCas9系统将Cas9核酸酶进行了核酸内切酶活性位点(D10A和H840A)失活突变，但不改变Cas9蛋白结合靶DNA的高亲和力和高特异性。因此，CRISPR/dCas9可以作为靶位点DNA捕获的高效率高特异性工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法。

本发明采用的技术方案为：

一种基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其步骤包括：