[发明专利]基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法在审
| 申请号： | 202110876431.4 | 申请日： | 2021-07-29 |
| 公开（公告）号： | CN113564227A | 公开（公告）日： | 2021-10-29 |
| 发明（设计）人： | 江翱;陈晶晶;卢瑶;苏杰;孙睿;王嫚;曹振;宋东亮 | 申请（专利权）人： | 翌圣生物科技（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/113 |
| 代理公司： | 苏州根号专利代理事务所(普通合伙) 32276 | 代理人： | 朱华庆 |
| 地址： | 200120 上海市浦*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 crispr dcas9 宿主 病原微生物 dna 快速 分离 方法 | ||
1.一种基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其步骤包括：
(1)设计覆盖宿主全基因组的sgRNA探针，所有的sgRNA探针组成sgRNA库；
(2)根据步骤(1)中设计的sgRNA库，合成sgRNA引物，并混合成sgRNA引物库；
(3)使用步骤(2)获得的宿主全基因组sgRNA引物库，引物和引物自身相互扩增，从而扩增出全基因组sgRNA的双链DNA模板；
(4)根据步骤(3)中的双链DNA模板，体外转录sgRNA库，DNase I消解，回收sgRNA库；
(5)将步骤(4)中获得的sgRNA库，与带标签的dCas9蛋白孵育组装，获得dCas9-sgRNA复合物；
(6)将步骤(5)组装的dCas9-sgRNA复合物与待测宿主样本DNA孵育；
(7)用亲和磁珠或树脂特异性捕获带对应标签的dCas9-sgRNA-宿主DNA复合物；
(8)步骤(7)中捕获后上清的DNA，即为富集的病原微生物DNA；
(9)将步骤(7)中的亲和磁珠或树脂洗脱，即为宿主基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(1)中sgRNA库相对均匀地覆盖宿主全基因组，相邻两个sgRNA探针的靶位点之间的距离不高于2Mbp。
3.根据权利要求2所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：sgRNA库中每条sgRNA探针的SAE值中的特异性分数和效率分数不低于0.4，sgRNA探针在微生物基因组DNA上没有靶位点或上靶位点的特异性分数不高于0.2。
4.根据权利要求3所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：sgRNA引物库中的每条引物的投入摩尔量基本相同。
5.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：sgRNA引物库中的每条引物为在sgRNA探针的5’端加上T7启动子序列，3’端加上tracrRNA序列。
6.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(4)中体外转录使用T7 RNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(5)dCas9蛋白是经核酸内切酶活性位点失活突变的Cas9蛋白。
8.根据权利要求7所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(5)中带标签的dCas9蛋白是biotin-dCas9、Spy-dCas9或Flag-dCas9。
9.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(7)中亲和磁珠为链霉亲和素磁珠、SNAP-tag磁珠或Anti-flag磁珠。
10.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(7)中亲和树脂为链霉亲和素琼脂糖树脂或Anti-flag琼脂糖树脂。
11.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：步骤(5)中dCas9与sgRNA的总摩尔比为1：4-1：96。
12.根据权利要求1所述的宿主与病原微生物DNA快速分离方法，其特征在于：sgRNA库总量与DNA总量的投入质量比为30：1-300：1。
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