[发明专利]一种同时检测动物源性食品中四十八种兴奋剂的方法

权利要求书

1.一种同时检测动物源性食品中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，所述同时检测的四十八种兴奋剂为克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、肾上腺素、普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、克仑丙罗、曲托喹酚、去甲乌药碱、美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地酮、群勃龙、睾酮、β-玉米赤霉醇、泽仑诺、齐帕特罗、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、可的松、氢化可的松、乙酰唑胺、坎利酮、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、卞氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氨苯蝶啶和4-氨基-6-氯苯-1，3二磺酰胺，包括如下步骤：

步骤1，按如下方式获得不同动物源性食品相应的待测液：

步骤1a，在畜禽肉、畜禽肉制品、蛋或蛋制品形成的试样中加入与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质形成的混合同位素内标中间液，之后加入甲酸的乙腈溶液涡旋振荡10～30min，甲酸的乙腈溶液中甲酸占整个溶液体积的1％，然后加入无水硫酸钠涡旋振荡2～5min，无水硫酸钠和所述试样的质量比为(2～5)g：(4.88～5.12)g，在6000～8500r/min下离心3～6min得到上清液，然后剩余固体部分用相同的方式进行提取，合并两次上清液，得到上清液a，将上清液a在30～50℃下吹干，得到残渣a，将残渣a用乙腈的水溶液溶解，乙腈和水的体积比为1:1，最后涡旋振荡、过滤，得到待测液a；

步骤1b，当所述的动物源性食品为水产品或水产品制品时，将水产品或水产品制品按照步骤1a对应的方式处理，得到上清液b，使用Cleanert MAS-Q净化管将上清液b的脂肪和水分去除后，将所得上清液在30～50℃下吹干，得到残渣b，将残渣b用含甲酸的乙腈水溶液溶解，涡旋振荡后加入正己烷，正己烷和水产品或水产品制品的比例为3mL：(4.88～5.12)g，涡旋振荡1～5min，在6000～8500r/min下离心2～5min，最后过滤，得到待测液b；

步骤1c，当所述的动物源性食品为乳时，将乳按照步骤1a的方式处理，并且将甲酸的乙腈溶液替换为乙腈，得到待测液c；

步骤1d，当所述的动物源性食品为乳制品时，在乳制品形成的试样中加入步骤1a所述的混合同位素内标中间液，之后用饱和氯化钠溶液和乙腈提取，饱和氯化钠溶液和所述试样的比例为(2～5)mL：(4.88～5.12)g，从得到的提取液中分离出上清液，然后将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，剩余过程与步骤1a相应的过程相同，得到待测液d；

步骤2，将待测液a、待测液b、待测液c和待测液d按照相同的条件，用C18色谱柱串联质谱仪进行测定，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为甲酸的甲醇溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，梯度洗脱程序如下：0～1min内，流动相A的体积比例保持95％；1～2min内，流动相A的体积比例由95％线性减小至80％；2～6min内，流动相A的体积比例由80％线性减小至40％；6～8min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至20％；8～8.5min内，流动相A的比例由20％线性减小至10％，8.5～10.5min内，流动相A的比例保持10％，10.5～11min内，流动相A的体积比例由10％线性增加至95％，11～15min内，流动相A的比例保持95％，得到相应的谱图信息；

将由所述的四十八种兴奋剂标准物质和与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制的混合标准工作液，用与待测液a相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；

步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中除倍他米松和地塞米松外所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；

将步骤2所述的四种待测液按照相同的条件，用BEH C18色谱柱串联质谱仪进行测定，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～15min内，流动相A的体积比例保持75％；15～15.1min内，流动相A的体积比例由75％线性减小至20％；15.1～20min内，流动相A的体积比例保持20％；20～20.1min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至75％；20.1～25min内，流动相A的比例保持75％，得到相应的谱图信息；将该谱图信息与混合标准工作液对应的谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中倍他米松和地塞米松的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中倍他米松、地塞米松对应的内标物的峰面积；

步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比，质谱仪采用如下参数进行工作：离子源为电喷雾离子源，ESI⁺下的喷雾电压为3.5kv，ESI^-下的喷雾电压为2.5kv，扫描方式为多反应监测，离子传输管温度为350℃，雾化温度为350℃，鞘气压力为40Arb，辅助气压为10Arb，吹扫气压力为0Arb；

在进行谱图信息比对时，采用如下标准：待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3；

步骤4，采用如下第一个公式求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量，如下第二个公式求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量，完成动物源性食品中四十八种兴奋剂的同时检测；

式中：X_1i为试样中所述各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；X_2i为试样中各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；c为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的含量，单位为ng/mL；c_i为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；A为测试液中各个待测兴奋剂的峰面积；A_si为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；V为样液的提取体积，单位为mL；c_si为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；A_i为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；A_s为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的峰面积；m为样品的质量，单位为g；f为稀释倍数。