[发明专利]一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产L‑苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将L‑苯丙氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，初始发酵温度为35‑37℃，搅拌转速为200‑400rpm，风量30‑50L/min，罐压0.05‑0.1MPa，发酵过程中控制溶氧为15‑35％；发酵培养4‑6h后，加入IPTG进行诱导培养，诱导培养的温度为35‑37℃，控制溶氧为30‑40％，诱导培养40‑42h；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤0.5g/L时开始补糖，通过流加葡糖糖溶液使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5‑1g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，即生产得到含有L‑苯丙氨酸的培养液。采用本发明的方法可以实现L‑苯丙氨酸的工业化生产，并显著提高了L‑苯丙氨酸的产率。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法。

背景技术

L-苯丙氨酸(L-Phe)是人和动物体不能合成的8种必需氨基酸之一，广泛应用于功能性食品、动物饲料和医药等行业。L-苯丙氨酸与L-天冬氨酸组成的二肽化合物阿斯巴甜，是一种高甜度、低热量的甜味剂，在减肥饮料和食品领域中备受青睐，市场对于其原料L-苯丙氨酸的需求量也在快速增长。

L-苯丙氨酸主要由化学合成法、酶法、微生物发酵法等方法来生产，其中，化学合成法因其生产路线长、副产物多、且产物为消旋体不宜推广使用；酶法主要是由化学合成的类氨基酸前体经过微生物细胞内酶系高效专一的催化合成L-苯丙氨酸，然而由于底物和酶等主要原料成本高以及来源有限，反应过程中酶稳定性差等缺点，酶法生产L-苯丙氨酸也受到严重制约；微生物发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-苯丙氨酸的一种方法，具有原料廉价易得、环境污染小、产物纯度高等优点，目前已成为工业化生产L-苯丙氨酸的主要方法。

但是，L-苯丙氨酸的生物合成是最复杂的氨基酸合成途径之一，L-苯丙氨酸等终产物对其合成代谢途径的关键酶的酶活和/或酶的表达量具有强烈的反馈抑制或阻遏，使L-苯丙氨酸的过量积累受到限制。因此，通过微生物发酵法生产L-苯丙氨酸的难点在于：对途径间的竞争抑制进行消除，或消除途径内的反馈抑制。目前虽已有通过基因工程技术构建重组菌体提高或抑制关键酶表达，优化发酵过程的报道，但由于L-苯丙氨酸的合成代谢途径复杂，涉及的酶类众多，若各种酶的表达不能相互匹配，会导致中间代谢物的积累，对细胞造成毒性。而且，在实际工业化发酵生产中，由于放大效应而导致菌株生产性能的显著下降，使得现有发酵生产L-苯丙氨酸的产率仍有待进一步提高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法。采用本发明的方法可以实现L-苯丙氨酸的工业化生产，并显著提高了L-苯丙氨酸的产率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将L-苯丙氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，初始发酵温度为35-37℃，搅拌转速为200-400rpm，风量30-50L/min，罐压0.05-0.1MPa，发酵过程中控制溶氧(DO)为15-35％；

发酵培养4-6h后，加入IPTG进行诱导培养，诱导培养的温度为35-37℃，控制溶氧(DO)为30-40％，诱导培养40-42h；

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤0.5g/L时开始补糖，通过流加葡糖糖溶液使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-1g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，即生产得到含有L-苯丙氨酸的培养液。

优选的，步骤(1)中，所述L-苯丙氨酸生产菌由如下方法构建而成：