[发明专利]一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法

权利要求书

1.一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将L-苯丙氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，初始发酵温度为35-37℃，搅拌转速为200-400rpm，风量30-50L/min，罐压0.05-0.1MPa，发酵过程中控制溶氧为15-35％；

发酵培养4-6h后，加入IPTG进行诱导培养，诱导培养的温度为35-37℃，控制溶氧为30-40％，诱导培养40-42h；

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤0.5g/L时开始补糖，通过流加葡糖糖溶液使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-1g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，即生产得到含有L-苯丙氨酸的培养液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述L-苯丙氨酸生产菌由如下方法构建而成：

将质粒pET-28a(+)用NcoⅠ和SacⅠ双酶切处理，将aroB基因整合到双酶切处理后的质粒pET-28a(+)上，得到重组质粒pET-aroB，再用EagⅠ和XhoⅠ对重组质粒pET-aroB进行酶切处理，将aroE基因整合到酶切处理后的重组质粒pET-aroB上，获得第一重组表达载体；

将质粒pGEX-2T用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切处理，将aroF基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX-2T上，得到重组质粒pGEX-2T-aroF，再用TthlllⅠ和AatⅡ对重组质粒pGEX-2T-aroF进行酶切处理，pheA基因整合到酶切处理后的重组质粒pGEX-2T-aroF上，获得第二重组表达载体；

将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到同一大肠杆菌酪氨酸营养缺陷型菌株中，构建得到L-苯丙氨酸生产菌；

所述aroB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述aroE基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述aroF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述pheA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨2g/L、玉米浆10g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2g/L、硫酸镁1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 9mg/L、硫酸锌12.8mg/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 9.8mg/L、CuSO₄·5H₂O 1.2mg/L、维生素B1 0.3mg/L、维生素H 0.3mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力15,000PSI，均质流量400L/Hr。