[发明专利]一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法

说明书

本发明提供一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法，属于植物基因工程技术领域。本发明首次构建了黄麻黄脉病毒的侵染性克隆pBINPLUS‑CoYVV‑1.2A和pBINPLUS‑CoYVV‑2.0B，该侵染性克隆能使接种黄麻产生黄脉、花叶、斑驳、卷叶等症状，这为研究黄麻黄脉病毒基因组的结构和功能及其致病机制奠定基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

黄麻黄脉病毒（Corchorus yellow vein Vietnam virus，CoYVV）是单链、环状植物DNA双生病毒，属于菜豆金色花叶病毒属，其基因组为双组份（即DNA-A和DNA-B）。CoYVV于2006年首先在越南的黄麻上被发现，于2015在我国福建地区的黄麻上也鉴定到该病毒。虽然是旧世界发现的病毒，但CoYVV具有典型的新世界双生病毒特征，即不编码AV2蛋白。黄麻（Corchorus capsularis），又称为绿麻、火麻等，是椴树科（Tiliaceae）黄麻属（Corchorus）重要的纤维作物，种植量和用途的广泛度仅次于棉花，我国长江以南广泛栽培。CoYVV可侵染黄麻并造成叶片黄脉、植株矮化等症状，影响黄麻产量与品质，给我国黄麻产业带来潜在威胁。因此，研究CoYVV的基因组结构、功能及其致病机制，对黄麻生产具有重要的意义。而病毒侵染性克隆的构建是研究病毒致病机制的首要选择。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法。本发明首次构建了黄麻黄脉病毒的侵染性克隆，为研究该病毒基因组的结构和功能及其致病机制奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建方法，主要包括如下步骤：

（1）提取黄麻叶片总DNA，以此为模板，设计特异性引物CoYVV-DNA-A-F1/CoYVV-DNA-A-R1、CoYVV-DNA-A-F2/CoYVV-DNA-A-R2进行PCR扩增，获得长度分别为2.7 kb的片段A和0.5 kb的片段B。

（2）利用多片段无缝克隆技术，将凝胶纯化后的片段A和片段B与经BamH I和Sma I对pBINPLUS载体进行双酶切的酶切产物pBINPLUS-SB进行连接，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用BamH I和Sma I双酶切验证重组质粒，筛选所得阳性克隆即为DNA-A侵染性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-1.2A。

（3）以黄麻叶片总DNA为模板，利用φ29 DNA聚合酶进行滚环扩增（RCA），将扩增产物利用BamH I酶切得到2.7 kb的片段，连接于pTOPO载体，即为pTOPO-DNA-B。

（4）利用BamH I和Sma I对pTOPO-DNA-B进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收2.6kb片段C，将片段C连接至经BamH I和Sma I对pBINPLUS载体进行双酶切的酶切产物pBINPLUS-SB，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用BamH I和Sma I双酶切验证，筛选阳性克隆，标记为pBINPLUS-DNA-B。

（5）利用BamH I对pBINPLUS-DNA-B质粒进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，进行去磷酸化处理。

（6）利用BamH I对pTOPO-DNA-B进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收2.7 kb片段D，将片段D与步骤（5）去磷酸化的载体连接，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用引物B-F570/ B-R570检测插入片段及其方向，筛选阳性克隆即为DNA-B侵染性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-2.0B。