[发明专利]一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法

权利要求书

1.一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)提取黄麻叶片总DNA，以此为模板，设计特异性引物CoYVV-DNA-A-F1/CoYVV-DNA-A-R1、CoYVV-DNA-A-F2/CoYVV-DNA-A-R2进行PCR扩增，获得长度分别为2.7kb的片段A和0.5kb的片段B；

(2)利用多片段无缝克隆技术，将凝胶纯化后的片段A和片段B与经BamH I和Sma I对pBINPLUS载体进行双酶切的酶切产物pBINPLUS-SB进行连接，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用BamH I和Sma I双酶切验证重组质粒，筛选所得阳性克隆即为DNA-A侵染性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-1.2A；

(3)以黄麻叶片总DNA为模板，利用φ29DNA聚合酶进行滚环扩增，将扩增产物利用BamHI酶切得到2.7kb的片段，连接于pTOPO载体，即为pTOPO-DNA-B；

(4)利用BamH I和Sma I对pTOPO-DNA-B进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收2.6kb片段C，将片段C连接至经BamH I和Sma I对pBINPLUS载体进行双酶切的酶切产物pBINPLUS-SB，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用BamH I和Sma I双酶切验证，筛选阳性克隆，标记为pBINPLUS-DNA-B；

(5)利用BamH I对pBINPLUS-DNA-B质粒进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，进行去磷酸化处理；

(6)利用BamH I对pTOPO-DNA-B进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收2.7kb片段D，将片段D与步骤(5)去磷酸化的载体连接，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒，利用引物B-F570/B-R570检测插入片段及其方向，筛选阳性克隆即为DNA-B侵染性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-2.0B；

(7)利用电击法将含有DNA-A和DNA-B的侵染性克隆pBINPLUS-CoYVV-1.2A和pBINPLUS-CoYVV-2.0B分别转入农杆菌GV3101感受态细胞；将含有病毒DNA-A和DNA-B侵染性克隆的农杆菌菌液，经由接种缓冲液处理后，接种刚长出2～3片真叶的黄麻叶片，使接种黄麻产生黄脉、花叶、斑驳、卷叶症状；并且利用PCR和Southern blot检测病毒组分；

步骤(1)中所述特异性引物序列如下：

CoYVV-DNA-A-F1：5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCACCGTGCAGCAGCCCCGC-3’；CoYVV-DNA-A-R1：5’-GGCTGCTGCACGGTAATATTATAGGCGTGCAGCAGCG-3’；

CoYVV-DNA-A-F2：5’-AATATTACCGTGCAGCAGCCCCGC-3’；

CoYVV-DNA-A-R2：5’-AATTCGAGCTCGGTACCCGGGTGACCTTCCCTGTATGAGCA-3’。

2.根据权利要求1所述的一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于：步骤(6)中所述引物序列如下：

B-F570：5’-GACGAACCGTCACGTGCATCCACG-3’；

B-R570：5’-TGTCGACAGCAAAGCACTCTGTTG-3’。

3.根据权利要求1所述的一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于：步骤(7)中PCR检测引物序列如下：

A-F534：5’-AGGATCTATCGGACCTATAGGTCC-3’；

A-R534：5’-AGGATTAGAGGCATGAGTACATGC-3’；

B-F673：5’-ACGAATATCGTCTGACTCATGACC-3’；

B-R673：5’-TCCAGCATACTTGTGCTGAGTCTG-3’。

4.一种权利要求1所述方法构建所得的黄麻黄脉病毒侵染性克隆。

5.权利要求4所述的黄麻黄脉病毒侵染性克隆在黄麻黄脉病毒基因组的结构和功能及其致病机制研究中的应用。