[发明专利]一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种用于重组蛋白表达的甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇，所述甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇的基因组DNA序列包括如NCBI登录号为NC_012963.1的5’端起第2416633位至第2417632位所示的碱基序列。本发明还公开了一种用于重组蛋白表达的组成型启动子P₀₄₇₂，所述组成型启动子P₀₄₇₂的基因组DNA序列包括如NCBI登录号为NC_012964.1的5’端起第874193位至第875192位所示的碱基序列。本发明的甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇和组成型启动子P₀₄₇₂可以在大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种用于大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达的启动子及其应用。

背景技术

甲基营养型毕赤酵母是应用最广泛的重组蛋白表达系统之一。迄今为止，已通过该系统成功表达了5000多种蛋白质。大多数情况下，蛋白质表达依赖于甲醇诱导型启动子P_AOX1(酒精氧化酶I启动子)。此外，GAP启动子(P_GAP)是最常见无需诱导的组成型启动子。

除P_AOX1和P_GAP外，毕赤酵母中还报道了一些其他启动子，例如谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶启动子(P_FLD1)和二羟基丙酮合酶启动子(P_DAS)。Prielhofer等人鉴定了P_G1和P_G6，它们由低浓度葡萄糖诱导并被甘油抑制。除诱导型启动子外，还报道了一些组成型启动子，包括翻译延伸因子1(TEF1)启动子、GTPase(YPT1)启动子和潜在的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GCW14)启动子。Ahmad、Hirz、Pichler和Schwab提供了来源于毕赤酵母中的上述启动子的总结(Protein expression in Pichia pastoris:recent achievements andperspectives for heterologous protein production)。然而，由于表达强度、诱导条件和调节严格性方面的各种缺陷，这些启动子并未得到广泛使用。例如，P_FLD1的诱导不仅需要甲醇作为唯一碳源，还需要硫酸铵作为氮源；许多启动子如P_G1、P_G6和少数组成型启动子的强度不足以支持大规模的重组蛋白表达。因此，启动子在毕赤酵母中的应用相当有限，这就需要筛选其他新的强启动子。

发明内容

为鉴定新的诱导型或组成型启动子，本发明基于三种不同碳源(葡萄糖、甘油和甲醇)条件下的毕赤酵母野生型GS115菌株RNA-seq数据和mRNA折叠自由能(ΔG)选择了 16个候选启动子。在这些启动子后插入GFP报告基因和重组α-淀粉酶以测试它们的表达强度和诱导能力。最后，本发明确定了两个有希望用于重组蛋白表达的新型启动子：甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇和组成型启动子P₀₄₇₂。经实验，使用α-淀粉酶作为报告蛋白， P₀₅₄₇和P₀₄₇₂的启动子强度在摇瓶实验中与P_AOX1和P_GAP相当，但在补料分批培养中分别比 P_AOX1和P_GAP高5-10％和25-30％。

因此本发明的第一个目的在于提供一种用于大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达的甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇和组成型启动子P₀₄₇₂。

本发明的第二个目的在于提供一种甲醇诱导型启动子P₀₅₄₇或组成型启动子P₀₄₇₂在大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：