[发明专利]一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其制剂

说明书

本发明公开了一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其制剂，该制剂的制备包括以：过氧化氢酶‑光敏剂胶束的制备，载过氧化氢酶‑光敏剂胶束的ROS响应脂质体的制备，外泌体的提取及分离纯化，将脂质体与外泌体混合，挤出法介导脂质体与外泌体间的膜融合，将膜融合载体与凝胶混合，搅拌均匀制得。本发明制备的制剂将光动力治疗与生物治疗联用，利用膜融合载体包裹过氧化氢酶‑光敏剂胶束，于创面消除堆积的过氧化氢并补氧，光敏剂产生可控的单线态氧抗炎杀菌，为外泌体治疗创面创造有利条件，同时凝胶本身对于伤口创面愈合也提供了有利的湿润环境，安全性高，稳定性好，敷用方便，加工工艺简单，成本低，有着良好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)的制备方法及其制剂。

背景技术

创面愈合依赖于许多生理过程，包括细胞迁移(炎症细胞向损伤部位转移)、细胞增殖(血管母细胞和成纤维细胞)、细胞凋亡以及通过合成细胞外基质(ECM)蛋白重建真皮层，当炎症细胞因过度反应而产生过量活性氧(ROS)如超氧阴离子、H₂O₂时、单线态氧等引起组织坏死、血管功能障碍等使创面难以愈合，长期不愈合的创面又会引起其他感染，进入恶性循环。一个良好的创面愈合过程需要抑制或杀死引起严重感染的病原菌，减少活性氧的产生，以为后续血管及组织新生等关键阶段创造有利环境。

脐带间充质干细胞来源的外泌体近年成为创面愈合中的研究热点，其表面表达的CD73、CD90、CD105等细胞因子，既可以通过定位损伤和炎症部位，也可以通过释放旁分泌因子如组织修复因子、血管生成素、免疫调节因子等促进创面愈合，参与创面愈合过程中的炎症调节、血管新生、上皮胶原沉积等一系列重要过程，且无免疫原性，但由于其易受创面部位缺氧环境的影响而难以发挥最佳生物活性，同时其产量低、载药量差也进一步限制了其应用。因此，有必要发明一种新型载体，在保留外泌体生物活性的同时，提高其载药效果，同时与其他成分协同起效，有效促进创面愈合。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题及创面的治疗需求，本发明提供一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)的制备方法，本发明制备的制剂是一种载有过氧化氢酶-光敏剂胶束的ROS响应型脂质体-外泌体膜融合制剂。本发明利用创面部位ROS堆积的特点，制备ROS响应的脂质体-外泌体膜融合制剂，其中过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)释放后，CAT于原位清除创面部位因炎症反应产生的过量H₂O₂，并产生O₂，同时Ce6在激光与O₂作用下产生可控的、适量的单线态氧，抗炎同时有效杀灭创面微生物，为后续外泌体发挥强大的免疫调节、促进组织及血管新生创造有利环境。

本发明还提供所述协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂。

技术方案：为了实现上述方案，本发明提供所述一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：将光敏剂Ce6溶解于溶剂中，加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，室温下避光搅拌，得到活化的Ce6，加入过氧化氢酶进行酯化反应，得到过氧化氢酶-光敏剂(CAT-Ce6)单体，透析法制备得到CAT-Ce6-m；

(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束的ROS响应型脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：称取磷脂，胆固醇在有机溶剂中超声溶解，减压成膜，除去有机溶剂，加入过氧化氢酶-光敏剂胶束水合，得到CAT-Ce6-m@lip；

(3)干细胞外泌体(exo)的提取及分离纯化：培养间充质干细胞，超速离心法提取外泌体；