[发明专利]一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法

说明书

一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，涉及一种蛋白酶体外合成胞外多糖方法。体外合成胞外多糖方法：一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中发酵；二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖。本发明方法通过系列生物化学技术获得葡聚糖蔗糖酶，经合成、提取技术纯化获得高纯度多糖。本发明方法中葡聚糖蔗糖酶在底物蔗糖的诱导下，产生大量胞外多糖；具有产糖周期短、产糖量高、纯度高的优点。

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶体外合成胞外多糖方法。

背景技术

多糖(polysaccharides)是由多个单糖分子经脱水、缩合，由糖苷键连接成的天然高分子聚合物，它广泛存在于高等植物、真菌、藻类、细菌及动物体细胞中，是构成生命的四大基本物质之一。胞外多糖(EPS，exopolysaccharides)作为微生物生长过程中代谢的长链多糖，由重复单元的糖或糖的衍生物、不同比例葡萄糖、半乳糖及鼠李糖组成。研究发现微生物胞外多糖对心脑血管、肿瘤和急慢性炎症等疾病具有预防和治疗作用，在调节免疫、降血压、降血糖、降低胆固醇和甘油三酯，抗肿瘤、抗炎、抗血小板凝集、抗氧化及抗衰老等方面具有独特的生物活性，而且毒副作用低。此外，胞外多糖所特有的流变学特性，使其可作为增稠剂、稳定剂、胶凝剂、乳化剂等广泛应用在食品行业、医药行业及化工行业。

葡聚糖蔗糖酶(dextransucrase或glucosyltransferase)是一种由乳酸菌、某些酵母菌及枯草芽孢杆菌等微生物发酵产生的胞外糖基转移酶，能以蔗糖为受体底物、在无其它物质参与反应时生成EPSs；当有可识别的外源受体存在时，也能将葡糖基转移给外源受体而生产各种糖基化产物。因葡聚糖蔗糖酶反应的特异性、产物的多样性以及对于产物合成的可操作性而使其成为生物催化合成中一种重要的工具酶。目前国内外有许多产EPSs的微生物被分离出来，对EPSs也做了大量的研究，其许多生物活性也被发现。不同微生物生产EPSs的能力不同，产量普遍较低等，这些都限制了EPSs的应用，因此利用葡聚糖蔗糖酶体外合成EPSs不仅可以提高EPSs的产量，还可以简化分离纯化手段，提高提取率，为定向改造EPSs提供前提基础，为开发功能性EPSs提供理论依据。

发明内容

本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，该方法操作简便，具有胞外多糖产量高、纯度高等优点。

葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法：

一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；

二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；

三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；

四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；

其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K₂HPO₄的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO₄·7H₂O的浓度为0.58g/L、MnSO₄·4H₂O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；

步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为40～160g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为1～10U/mL、CaCl₂的添加量为0～6mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.0～7.0、摇床转速为0～200rpm，反应时间1～10h。