[发明专利]一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法

权利要求书

1.一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖按以下步骤实现：

一、将柠檬明串珠菌接种于产酶液体培养基中，在30±1℃、静止培养20±1h，得到发酵液；

二、将发酵液离心，取上清液，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；

三、葡聚糖蔗糖酶粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、浓缩和层析纯化，得到葡聚糖蔗糖酶纯酶液；

四、用葡聚糖蔗糖酶纯酶液体外催化蔗糖合成胞外多糖；

其中，步骤一产酶液体培养基中蔗糖的浓度为20g/L、胰蛋白胨的浓度为10g/L、牛肉浸粉的浓度为10g/L、酵母浸粉的浓度为5g/L、K₂HPO₄的浓度为2g/L、柠檬酸铵的浓度为2g/L、无水乙酸钠的浓度为5g/L、MgSO₄·7H₂O的浓度为0.58g/L、MnSO₄·4H₂O的浓度为0.25g/L、吐温80的浓度为1mL/L，产酶液体培养基pH值为5.5；

步骤四体外催化反应体系中蔗糖浓度为40～160g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为1～10U/mL、CaCl₂的添加量为0～6mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.0～7.0、摇床转速为0～200rpm，反应时间1～10h。

2.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤一所述柠檬明串珠菌为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)B-2；柠檬明串珠菌的接种量为1％(V/V)。

3.根据权利要求1或2所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤四中体外催化反应体系中蔗糖浓度为100g/L、葡聚糖蔗糖酶的添加量为8U/mL、CaCl₂的添加量为3mM；体外催化反应温度为30℃、pH为5.5、摇床转速为80rpm，反应时间6h。

4.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤二在4℃、8000rpm条件下离心20min。

5.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于步骤三向葡聚糖蔗糖酶粗酶液中加入硫酸铵，硫酸铵终浓度为55％(W/V)，之后将粗酶液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中、4℃条件下透析24h；然后用聚乙二醇浓缩，浓缩液再用DEAE-sepharose FF阴离子交换层析和Sepadex G75分子筛层析纯化。

6.根据权利要求1所述的一种葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖方法，其特征在于对外催化蔗糖合成的胞外多糖进行纯化：步骤四合成的胞外多糖用三氯乙酸去蛋白，再用乙醇沉淀多糖，之后进行透析，既得到纯胞外多糖。