[发明专利]一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法。本发明所提供的基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法将单细胞捕捉、细胞裂解、mRNA萃取、反转录等一系列步骤均集成在一张微流控芯片上进行，简化了现有的单细胞mRNA逆转录工艺，在减少污染的同时便于全自动化单细胞测序样品处理仪器的使用，降低人为操作带来的误差，保证了检测结果具有更高的可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法。

背景技术

单细胞测序是在单个细胞水平上对包括基因组、转录组（Transcriptome）和表观遗传组在内的组学测序技术。 其中，转录组广义上是指在某一特定生理条件下，一个细胞、组织或生物体内所有转录产物的总和，包括编码 RNA（rRNA、tRNA、mRNA）和非编码 RNA；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。与基因组不同的是，转录组的研究有着时间和空间上的限制，即同一细胞在不同的生长阶段和环境下，其基因的表达情况是有所差别的。scRNA-seq首先是构建cDNA文库，然后进行全转录组cDNA的扩增和测序，其中转录组的扩增是该技术的关键步骤。

目前，单细胞转录组测序平台有很多，从最初的人工操作方法，到各高通量大规模平台，科研工作者可以根据不同的研究目的，利用各个层面的技术来深入挖掘细胞异质性。但是现有的单细胞mRNA逆转录过程比较繁琐，如论是人工single tube法、基于微孔板技术平台或是基于微流控平台其反转录过程均需在离心管中进行，大大增加被污染的可能性，影响检测的结果。目前还没有一种操作简便、不需要进行转移的单细胞mRNA逆转录方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题提供一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法。本发明所提供的方法解决了现有的单细胞mRNA逆转录操作程序复杂、易污染的问题。同时便于全自动化单细胞测序样品处理仪器的使用，降低人为操作带来的误差，保证了检测结果具有更高的可靠性。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供了一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法，所述单细胞mRNA逆转录方法包括以下步骤：

（1）芯片处理及细胞、磁珠的装载；

（2）分离单细胞，进行细胞裂解；

（3）mRNA进行逆转录得到cDNA，逆转录过程在微流控芯片中进行；

（4）以cDNA为模板进行PCR扩展，构建测序文库。

步骤（2）中所述细胞裂解为加入细胞裂解液和RT抑制剂后立即用FC-40氟化液油封，所述细胞裂解液和RT抑制剂的体积用量比为39：1。

进一步地，所述细胞裂解液的配方为：每100 μL 的细胞裂解液中含有终浓度为2M的Tris-Hcl 5μL，终浓度为0.5M的 Licl 10 μL，终浓度为10%的Triton 0.5μL，终浓度为10mM的 EDTA 2μL，终浓度为5mM 的DTT 5μL，Dnase/Rnase-Free Water 72.5μL， dNTP mix5μL。

步骤（3）中所述的逆转录为在芯片中加入一定量的RT-Master mix体系，在滴入适量的1×RT buffer后将芯片放置于烘箱中。

所述烘箱的温度为40~45℃，时间为2~3h。

进一步地，所述的RT-Master mix体系中，每100 μL的RT-Master mix体系包含有2x Master mix 50 μL，终浓度为5mM 的DTT 10μL，Ts1 2.5 μL，RT Inibitor 2.5μL，Enzymatic RT酶 10μL、Dnase/Rnase-Free Water 25μL。