[发明专利]一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的单细胞mRNA逆转录方法，所述单细胞mRNA逆转录方法包括以下步骤：

（1）芯片处理及细胞和磁珠的装载；

（2）分离单细胞，进行细胞裂解；

（3）mRNA进行逆转录得到cDNA，逆转录过程在微流控芯片中进行；

（4）以cDNA为模板进行PCR扩展，构建测序文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解为加入细胞裂解液和RT抑制剂后立即用FC-40氟化液油封；所述细胞裂解液和RT抑制剂的体积用量比为39：1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解的配比为每100 μL 的细胞裂解液中含有终浓度为2M 的Tris-Hcl 5μL，终浓度为0.5M的Licl 10 μL，终浓度为10%Triton 0.5μL，终浓度为10mM 的EDTA 2μL，终浓度为5mM的 DTT 5μL，Dnase/Rnase-FreeWater 72.5μL， dNTP mix 5μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的逆转录为在芯片中加入一定量的RT-Master mix体系，在滴入适量的1×RT buffer后将芯片放置于烘箱中反应。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的RT-Master mix体系的配比为每100μL的RT-Master mix体系中包含有2 x Master mix 50 μL，终浓度为5mM 的DTT 10μL，Ts12.5 μL，RT Inibitor 2.5μL，Enzymatic RT酶 10μL、Dnase/Rnase-Free Water 25μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述烘箱的温度为40~45℃，时间为2~3h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述PCR扩展为拆除芯片，取出芯片内PDMS，放置在6 x SSC中充分震荡，取出磁珠；芯片中加入PCR mix后放入PCR仪进行反应；PCR程序为：95℃3min，98℃20s，65℃45s，72℃3min，GOTO Step 2，3X；98℃20s，67℃20s，72℃3min，GOTO Step 6，9X；72℃5min，4℃保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每50 μL所述的PCR mix中包含有5X HiFiwith Mgcl₂ buffer 10 μL，终浓度为10mM的 dNTP Mix 1.5 μL，HiFi HotStart 1 μL，磁珠扩增引物0.4 μL，Dnase/Rnase-Free Water37.1 μL。

9.一种细胞裂解液，其特征在于，每100 μL 细胞裂解液中含有终浓度为2M 的Tris-Hcl 5μL，终浓度为0.5M的 Licl 10 μL，终浓度为10%的Triton 0.5μL，终浓度为10mM的EDTA 2μL，终浓度为5mM 的DTT 5μL，Dnase/Rnase-Free Water 72.5μL， dNTP mix 5μL。

10.一种RT-Master mix体系，其特征在于，每100 μL的RT-Master mix体系中含有2 xMaster mix 50 μL，终浓度为5mM 的DTT 10μL，Ts1 2.5 μL，RT Inibitor 2.5μL，Enzymatic RT酶 10μL， Dnase/Rnase-Free Water 25μL。