[发明专利]一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法

说明书

本发明涉及单细胞分析领域，具体涉及一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。本发明提供一种低成本、简便的高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。本发明利用泊松分布原理使每个单细胞分配一个捕获磁珠，通过链特异性PCR可以完成单细胞TCR的富集，可有效提高细胞检测的通量，一次实验可以检测500‑10000个细胞，且无样本偏好性，具有较高的准确率。本发明所提供的检测方法中使用的主要试剂均为常用分子细胞生物学试剂，耗材中的微流控芯片以及捕获磁珠价廉易得，有效降低检测成本；整个检测操作过程简单，无需特殊仪器设备，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及单细胞分析领域，具体涉及一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。

背景技术

获得性免疫系统由B淋巴细胞和T淋巴细胞组成，其细胞表面均有负责特异性识别及结合抗原的分子，分别称为B细胞受体（BCRs）和T细胞受体( TCRs)。T细胞受体、B细胞受体和分泌型抗体的多样性构成复杂免疫系统的核心，并作为保护身体免受入侵病毒、细菌和其他物质的关键防御成分。TCR由异二聚体αβ链（~95％，TRA，TRB）或γδ链（~5％）组成，而BCR由两条重链（IGH）和两条轻链（IGK或IGL）组装而成。在结构上，每条链可分为可变结构域和恒定结构域。由于可变结构域上V（D）J基因重排以及种系核苷酸的随机缺失，TCR和BCR谱呈巨大的多样性。在人类中，从理论上估计TCR-αβ受体的多样性在胸腺中超过10¹⁸，TCR的多样性直接决定了TCR的抗原结合特异性。考虑到体细胞突变，B细胞受体的多样性甚至更大。

近年来，由于测序技术的发展，高通量测序（如RNA-Seq）已被用于解析免疫受体多样性，并转化应用于疫苗接种、癌症和自身免疫疾病。但是，传统RNA-seq检测到的是组织样本或细胞群的平均表达量，这使得细胞之间的差异有可能被平均值所掩盖，并且不能具体描述构成免疫反应的淋巴细胞或克隆型的多样性。因此，建立在单细胞层面检测TCR、BCR多样性的方法，对于推动免疫受体应用于临床早期诊断 、疗效评估、预后判断显得尤为重要。

目前，已有一些用于检测单细胞免疫受体的方法和试剂，如Clontech的SMARTerHuman scTCR a/b Profiling Kit试剂盒可以对TCR进行检测、10X Genomics推出的Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits试剂盒搭配配套仪器可以通过水油液滴包埋实现大量细胞的免疫受体序列的富集。但是上述的试剂或是检测通量小、不能同时检测BCR或转录本，或是对于一些类型的组织样本存在油滴包裹不完全的问题，且检测成本均比较高昂。急需开发一款检测成本低、高通量的检测单个免疫细胞表面受体核酸序列方法来实现对大量细胞的免疫受体序列的富集。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。该方法所用的主要试剂价格低廉，不需要特殊的仪器设备，可在普通实验室中进行大通量的单个免疫细胞表面受体核酸序列检测，一次实验可以检测500~10000个细胞，且无样本偏好性。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将PBMC细胞悬液台盼蓝染色后加至微流控芯片，通过微孔分离单个细胞，使每个孔中得到一个细胞；

（2）将能够捕获RNA的磁珠注入微流控芯片中，使PBMC细胞和磁珠在同一个微孔中；

（3）向微流控芯片中注入细胞裂解液，使细胞裂解释放出RNA，释放出的RNA被磁珠捕获；

（4）捕获完成后，取出带有RNA的磁珠，用反转录试剂进行反转录，合成CDNA第一链；

（5）反转录完成后的产物进行PCR富集TCR/BCR。

进一步地，步骤（1）中所述PBMC悬液的细胞浓度为1~2×10⁵ cells/mL，细胞活性大于85%。