[发明专利]一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法

权利要求书

1.一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法，特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将PBMC细胞悬液台盼蓝染色后加至微流控芯片，通过微孔分离单个细胞，使每个孔中得到一个细胞；

（2）将能够捕获RNA的磁珠注入微流控芯片中，使PBMC细胞和磁珠在同一个微孔中；

（3）向微流控芯片中注入细胞裂解液，使细胞裂解释放出RNA，释放出的RNA被磁珠捕获；

（4）捕获完成后，取出带有RNA的磁珠，用反转录试剂进行反转录，合成CDNA第一链；

（5）反转录完成后的产物进行PCR富集TCR/BCR。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述PBMC悬液的细胞浓度为1~2×10⁵ cells/mL，细胞活性大于85%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述微流控芯片的微孔数为1000~50000个。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述同一个微孔为每个微孔中同时含有一个PBMC细胞和一个能捕获RNA引物的条形码的磁珠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述细胞裂解液的组成成分中含有1 M ~2M Tris-Hcl 5μL，0.5 M~1M Licl 10 μL，10%~15%Triton 0.5μL，5~10mM EDTA2μL，5mM DTT 5μL，Dnase/Rnase-Free Water 72.5μL，dNTP mix 5μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的细胞裂解液的组成成分为：每100 μL的细胞裂解液中含有2M Tris-Hcl 5μL，0.5M Licl 10 μL，10%Triton 0.5μL，10mM EDTA2μL，5mM DTT 5μL，Dnase/Rnase-Free Water 72.5μL，dNTP mix 5μL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的反转录为在芯片中加入一定量的RT-Master mix体系，FC-40氟化液油封后将芯片放置于烘箱中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述烘箱的温度为40~45℃，时间为2~3h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的RT-Master mix体系中，每100 μL的RT-Master mix体系包含有2 x Master mix 50μL、DTT 10μL、Oligo dT 2.5μL、RTInibitor 2.5μL、Enzymatic RT酶 10μL、Dnase/Rnase-Free Water 25μL。

10.一种细胞裂解液，其特征在于，每100 μL所述的细胞裂解液中含有1 M ~2M Tris-Hcl 5μL，0.5 M~1M Licl 10 μL，10%~15%Triton 0.5μL，5~10mM EDTA 2μL，5mM DTT 5μL，Dnase/Rnase-Free Water 72.5μL，dNTP mix 5μL。