[发明专利]一种基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于MB‑LAMP检测鲣鱼的试剂盒及方法。本发明基于鲣鱼细胞色素b基因筛选了4条特异性引物，同时设计了1组环引物，并对其中1条环引物进行分子信标设计。当没有靶序列存在时，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。分子信标与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复，从而可以避免检测到由引物二聚体、发夹结构等造成的假阳性信号。本方法灵敏度高、特异性强，最低检测限可达0.5pg/μL。

技术领域

本发明涉及一种基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒及方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

鲣鱼(Katsuwonus pelamis)，属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Pereiformes)、鲭科(Scombridae)，是一种重要的经济性海洋鱼类，是世界金枪鱼渔业捕捞对象之一。2018年，鲣鱼捕捞量为316万吨，占金枪鱼捕捞总量的56％以上。在我国，金枪鱼的消费量逐年递增，市售金枪鱼种类繁多，其市场价格也差异悬殊。金枪鱼较少以鲜活的形式出售，多以冰鲜切片或罐头、鱼干等制品出现在市场上。消费者难以从外观上辨别出金枪鱼的真假和所属品种，这给不法商贩带来了可乘之机。为了获取高额的利润，常有用价格低廉的品种进行替换或掺入原料进行生产的情况发生。这种以次充好、掺假造假的违法行为不仅扰乱了市场秩序，更可能会导致严重的食品安全问题。为此，建立快速准确的鲣鱼鉴定技术尤为关键。

基于DNA的检测方法在物种鉴定方面已成为研究热点。黄曼虹等分别基于线粒体CO I和Cyt b基因设计大西洋三文鱼和虹鳟鱼特异性引物，建立了一种双重荧光PCR快速鉴定方法。袁方颖等开发一种三重PCR检测方法，检测食品中的大西洋鳕、狭鳕、黑线鳕3种鱼源性成分维护食品安全。然而PCR技术需要特殊的仪器和设备，对操作人员的技术要求高，因而限制了其广泛的应用。

近年来，核酸等温扩增技术在物种鉴定中发挥着重要作用。与PCR技术相比，等温核酸扩增反应是一种无需反复升降温，在同一温度下即可完成对靶标指数扩增的技术，其中，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是目前研究最多、最成熟的一种等温扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，在一小时内即可实现核酸扩增。检测结果只需用肉眼可视化观察，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳过程，在基层有着极为广泛的应用前景

但是，LAMIP产物易受气溶胶污染，造成假阳性结果。如反应后开盖时造成气溶胶的污染，其次，LAMP反应中使用的引物总浓度为3.6-4.4μM，，而在PCR反应中仅为0.4-1.0μM。其中LAMP的FIP和BIP引物长度为40-50bp，它们更容易形成引物二聚体或发夹结构，导致荧光染料与LAMP引物结合产生非特异性扩增。

分子信标(molecular beacon)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧光探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。

分子信标必须在适合反应的等温温度下与其靶标杂交，可以通过选择合适的探针和臂序列长度来实现，环部序列较长可增加探针与靶标结合的特异性，但是会降低与靶标的结合效率，同时会有可能形成二级结构，不利于LAMP的扩增检测；而环部较短会降低检测灵敏度，荧光基团与猝灭基团之间的距离减小，会增加意外猝灭的可能性。

综上所述，基于碱基互补配对原则来识别特定核酸序列是特异性检测的一种有效方法，急需开发出在传统LAMP技术的基础上利用分子信标探针在不同温度下发出荧光强度的差异对LAMP扩增产物进行检测方法用于鲣鱼检测。

发明内容