[发明专利]一种基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一组外引物对、一组内引物对、一个环引物和一个分子信标探针，所述外引物对为引物F3和引物B3，所述内引物对为引物BIP和引物FIP，所述环引物为引物LB，所述的分子信标探针为LFP，其序列如下所示：

F3：CCATTCCTACATACTTCAAAAC；

B3：CATCCGAGGATTTTGTTCTCT；

BIP：CCTACATTATCATCGCCCAAGTTTTTCTGCAAGTGGGAAGAAGATG；

FIP：CCGATTCAGGTAAGGATTGCCTTTTCACTTACATTCCGACCAGTC；

LB：GTCCGTCCTTTATTTCTCGTT；

LFP：FAM-AGCGGCTGCAATGAGGGTCCGCT-Dabcyl。

2.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针LFP全长23bp，所述分子信标探针LFP包括中环状区域和茎干区，所述中环状区域来自环引物LF前13个碱基CTGCAATGAGGGT，在环引物LF的5’端修饰荧光基团FAM，3’端修饰猝灭基团Dabcyl，所述环引物LF的序列如下：CTGCAATGAGGGTTCAAAATAA。

3.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测鲣鱼的试剂盒，其特征在于，所述引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、分子信标探针LFP的体积比为1:1:4:4:2:4。

5.一种基于MB-LAMP检测鲣鱼的方法，其特征在于，以待检测的物种基因组DNA为模板，利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行环介导等温扩增反应，根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。

6.根据权利要求4所述的基于MB-LAMP检测鲣鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测物种基因组DNA；

(2)引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LB、分子信标探针LFP的设计，所述引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB、分子信标探针LFP序列分别为：

F3：CCATTCCTACATACTTCAAAAC；

B3：CATCCGAGGATTTTGTTCTCT；

BIP：CCTACATTATCATCGCCCAAGTTTTTCTGCAAGTGGGAAGAAGATG；

FIP：CCGATTCAGGTAAGGATTGCCTTTTCACTTACATTCCGACCAGTC；

LB：GTCCGTCCTTTATTTCTCGTT；

LFP：FAM-AGCGGCTGCAATGAGGGTCCGCT-Dabcyl；

(3)在含有步骤(1)的待检测物种基因组DNA、步骤(2)的引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LB、分子信标探针LFP的LAMP反应体系内进行扩增，每分钟收集一次荧光信号进行实时荧光检测；

(4)根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。

7.根据权利要求6所述的基于MB-LAMP检测鲣鱼的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述扩增反应的反应体系为25μL的体系时，反应体系为2×Lamp Master Mix 12.5μL、10μM的引物F30.5μL、10μM的引物B30.5μL、10μM的引物FIP 2μL、10μM的引物BIP 2μL、10μM的引物LB1μL、10μM的分子信标探针LFP 1μL、8U/μL的DNAPolymerase 0.5μL、50ng模板DNA，其余为无菌水。