[发明专利]一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法

说明书

本发明涉及一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，包括以下步骤：S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，S2、发根农杆菌的活化和培养，S3、外植体的浸染，S4、共培养，S5、发根诱导和培养，S6、组织化学或荧光检测，S7、PCR检测。有益效果是：利用含35S:GUS报告基因的发根农杆菌Ar1193菌液浸染尾巨桉无菌芽苗，获得根部转化的嵌合体转基因植株，不仅可以大大缩短转化周期，实验结果也比较直观，且能够长期稳定表达；桉树离体毛状根体系为桉树基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，同时可以为在根部特异表达的高效营养利用和抗病的转基因桉树新品种的获得奠定基础。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法。

背景技术

桉树是桃金娘科桉树属的总称，原产于澳大利亚及其附近岛屿，目前是我国华南地区第一大造林树种，对于天然林保护、国家木材安全和森林碳汇增加等方面起到重要的作用。种植面积超过450万公顷，占全国年木材产量的26.9%。目前面临尺蛾等虫害、除草成本大等常规育种难以解决的问题。利用转基因技术培育抗病虫、抗除草剂等桉树转基因新品系，解决桉树的尺蛾、青枯病危害、严重冻害等问题的关键方法，对于解决我国木材供应具有重大意义。早期在赤桉、蓝桉、尾巨桉等桉树品种开展了转基因方法开展研究，仅获得转化愈伤组织或少量小苗(Girijashankar 2011)。但都存在着再生困难、转化效率低等问题。部分获得转基因植株或者品系，但存在着转化周期长，效率低等问题。近期在多种植物中以完整植株注射诱导等方式进行发根农杆菌诱导根系的遗传转化研究(Meng et al.2019)，在桉树中也开展了类似研究，但仍然存在着有性材料如下胚轴或者无法大批量开展研究等问题(Plasencia et al. 2016)。同时巨桉基因组测序已经完成，且已进行基因注释(Myburg et al. 2014)，这对挖掘桉树材性、生长等重要性状基因的挖掘具有重要意义。目前缺乏一套稳定高效的转基因体系，能够快速的进行外源基因的转化和功能验证。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，包括以下步骤：

S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，选择高度为2-3cm生长健壮的无菌桉树增殖芽苗，在超净工作台切下，将芽苗泡在装有无菌水的培养皿中待用；

S2、发根农杆菌的活化和培养，挑取带有35S: :GUS报告基因的发根农杆菌的菌液，在含有硫酸链霉素和卡那霉素的TY固体培养基上划平板，挑取单菌落，摇菌培养后重悬浮培养；

S3、浸染外植体，将无菌桉树增殖芽苗的茎基部在重悬菌液中浸染30mins；

S4、共培养，将浸染后的无菌桉树增殖芽苗插入到湿润的海绵中，使用无菌水喷施，无菌桉树增殖芽苗黑暗培养2天；

S5、发根诱导和培养，将插在海绵中的无菌桉树增殖芽苗转移后，在16h/8h光周期下培养30天，定期喷水和查看；

S6、GUS染色检测，将毛状根用GUS染色液浸染，使用LUYOR-3415RG手持式荧光观测仪和体视荧光显微镜进行观测；

S7、PCR检测，提取发状根的基因组DNA，进行目的基因的扩增。

其中，所述步骤S1中无菌桉树增殖芽苗为尾巨桉优良无性系芽苗。

其中，所述步骤S2中使用Bio-rad电激转化仪将含有35S: :GUS报告基因的载体pB1121质粒转入Ar1193的发根农杆菌感受态细胞。

其中，所述步骤S3中发根农杆菌重悬浮液的OD600值为0.5~0.7。

其中，所述步骤S4中在桉树增殖芽苗上放置在培养盆中培养，培养温度为24~25℃。