[发明专利]一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法

权利要求书

1.一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，

选择高度为2-3cm生长健壮的无菌桉树增殖芽苗，在超净工作台切下，将芽苗泡在装有无菌水的培养皿中待用；

S2、发根农杆菌的活化和培养，

挑取带有35S: :GUS报告基因的发根农杆菌的菌液，在含有硫酸链霉素和卡那霉素的TY固体培养基上划平板，挑取单菌落，摇菌培养后重悬浮培养；

S3、浸染外植体，

将无菌桉树增殖芽苗的茎基部放置在重悬菌液中浸染30mins；

S4、共培养，

将浸染后的无菌桉树增殖芽苗插入到湿润的海绵中，放置在培养盆中，使用无菌水喷施，密封保湿，无菌桉树增殖芽苗黑暗培养2天；

S5、发根诱导和培养，

将插在海绵中的无菌桉树增殖芽苗转移后，在16h/8h光周期下培养30天，定期喷水和查看；

S6、GUS染色检测，

取诱导的毛状根，使用GUS染色液浸染，或使用LUYOR-3415RG手持式荧光观测仪和荧光显微镜进行观测；

S7、PCR检测，

提取发状根的基因组DNA，进行目的基因的扩增。

2.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S1中无菌桉树增殖芽苗为尾巨桉优良无性系芽苗。

3.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S2中使用Bio-rad电激转化仪将含有35S: :GUS报告基因的载体pB1121质粒转入Ar1193的发根农杆菌感受态细胞。

4.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S3中发根农杆菌重悬浮液的OD600值为0.5~0.7。

5.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S4中在桉树增殖芽苗上放置在培养盆中培养，培养温度为24~25℃。

6.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S5中基部浸染的桉树增殖芽苗在22~25℃的培养温度下光照培养16h、暗培养8h，每隔2天使用无菌水喷施叶面保湿，每周更换一次无菌水。

7.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S6中将毛状根用GUS染色液浸染具体包括：将诱导的毛状根从培养盆中取出，用无菌水清洗后使用吸水纸将毛状根表面水吸干，然后放入玻璃瓶或培养管中，做好标记，加入GUS染色液，以刚好浸没毛状根为准，然后放置在恒温箱中，37℃暗处理12～24个小时后取出，使用无水乙醇清洗一次，然后换新鲜无水乙醇浸泡12小时后更换一次。

8.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S7中目的基因的扩增具体包括采用rolA引物、rolB引物和GUS引物进行PCR 扩增。