[发明专利]一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽及其筛选方法

说明书

本发明公开了一种牦牛乳酪蛋白DPP‑IV抑制肽及其筛选方法，涉及医药技术领域。本发明牦牛乳酪蛋白DPP‑IV抑制肽的氨基酸序列包括LPVPQK(β‑CN，f221‑226)，对DPP‑IV的作用模式为竞争性抑制，DPP‑IV抑制率为69.56±1.86％，IC₅₀值为4.38μM。抑制肽LPVPQK与DPP‑IV分子活性位点中在Glu205(A)、Ser630(A)和Glu206(A)三个位置形成氢键，且与Tyr666(A)、Phe357(A)、Tyr547(A)和Tyr662(A)四个位置形成疏水相互作用。本发明筛选方法开创性地将凝乳酶与木瓜蛋白酶联合降解牦牛乳酪蛋白，用于生产高活性DPP‑IV抑制肽，所得抑制肽LPVPQK对DPP‑IV的抑制率高，对糖尿病患者而言降低血糖安全可靠。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽及其筛选方法。

背景技术

DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂是糖尿病患者控制血糖的常用药物，通过减少DPP-IV对GLP-1(胰高血糖素样肽-1)的降解降低血糖水平，含有Xaa-Pro类似结构，可竞争性地结合DPP-IV的活化部位，具有化学合成类药物的副作用。

很多食源性多肽也含有Xaa-Pro类似结构，可起到DPP-IV抑制效果。DPP-IV抑制肽的结构特点一般有以下几个：N-末端含疏水性氨基酸(Trp/Leu/Ile/Phe)、2位上有Pro/Ala/Thr/His/Gly和/或C-末端有Trp/Phe/Pro，脯氨酸含量高的蛋白质产生DPP-IV抑制肽的潜力更大。

因此，开发食源性DPP-IV抑制剂是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽及其筛选方法。本发明牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽具有良好的DPP-IV抑制率，对糖尿病患者降低血糖安全可靠。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列包括LPVPQK(β-CN，f221-226)，SEQ ID NO：1。

作为本发明优选的技术方案，所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽与DPP-IV分子活性位点中在Glu205(A)、Ser630(A)和Glu206(A)三个位置形成氢键，且与Tyr666(A)、Phe357(A)、Tyr547(A)和Tyr662(A)四个位置形成疏水相互作用。

以上技术方案的有益效果：牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽LPVPQK结合于DPP-IV的活性位点，对DPP-IV产生竞争性抑制作用，因而可以缓解DPP-IV对胰高血糖素样肽-1的降解作用，实现降血糖的效果。

本发明的另一目的是，提供上述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，包括以下步骤：

(1)牦牛乳酪蛋白酶解处理：将牦牛乳酪蛋白润湿后添加无水碳酸钠搅拌至完全溶解，调节pH值，设置三个酶解组进行酶解处理，酶解后的产物经沸水浴灭酶、冰水浴冷却后离心，将上清液冻干，得酶解产物冻干粉；

所述三个酶解组分别是凝乳酶酶解组、木瓜蛋白酶酶解组、凝乳酶预处理酶解组；

(2)牦牛乳酪蛋白酶解产物超滤分离：将酶解产物冻干粉配制成多肽溶液，用过滤膜去除大分子杂质，再用带有超滤膜的超滤离心管对所述多肽溶液进行离心分离，收集＜3kDa滤液；

(3)超滤分离产物的LC-MS分析：将步骤(2)所得＜3kDa滤液上样LC-MS分析，并利用蛋白质谱分析软件进行氨基酸序列分析；