[发明专利]一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽及其筛选方法

权利要求书

1.一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的氨基酸序列包括LPVPQK。

2.根据权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽，其特征在于，所述DPP-IV抑制肽与DPP-IV分子活性位点中在Glu205(A)、Ser630(A)和Glu206(A)三个位置形成氢键，且与Tyr666(A)、Phe357(A)、Tyr547(A)和Tyr662(A)四个位置形成疏水相互作用。

3.一种牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)牦牛乳酪蛋白酶解处理：将牦牛乳酪蛋白润湿后添加无水碳酸钠搅拌至完全溶解，调节pH值，设置三个酶解组进行酶解处理，酶解后的产物经沸水浴灭酶、冰水浴冷却后离心，将上清液冻干，得酶解产物冻干粉；

所述三个酶解组分别是凝乳酶酶解组、木瓜蛋白酶酶解组、凝乳酶预处理酶解组；

(2)牦牛乳酪蛋白酶解产物超滤分离：将酶解产物冻干粉配制成多肽溶液，用过滤膜去除大分子杂质，再用带有超滤膜的超滤离心管对所述多肽溶液进行离心分离，收集＜3kDa滤液；

(3)超滤分离产物的LC-MS分析：将步骤(2)所得＜3kDa滤液上样LC-MS分析，并利用蛋白质谱分析软件进行氨基酸序列分析；

(4)潜能DPP-IV抑制肽的识别：对步骤(3)所得氨基酸序列分析结果，将凝乳酶预处理酶解组的氨基酸序列中与凝乳酶酶解组相同的氨基酸序列或与木瓜蛋白酶酶解组相同的氨基酸序列排除，再将水溶性差的片段和已公开的DPP-IV抑制肽片段排除，剩余的氨基酸序列中与DPP-IV抑制肽结构相似的确定为潜能DPP-IV抑制肽；

(5)潜能DPP-IV抑制肽活性鉴定。

4.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述三个酶解组酶解处理条件分别为：

凝乳酶酶解组：酪蛋白用凝乳酶酶解0.5h，凝乳酶添加量为每克酪蛋白添加120U凝乳酶；

木瓜蛋白酶酶解组：酪蛋白用木瓜蛋白酶酶解2h，木瓜蛋白酶的添加量为每克酪蛋白添加3000U木瓜蛋白酶；

凝乳酶预处理酶解组：酪蛋白先用凝乳酶酶解0.5h，再用木瓜蛋白酶酶解2h，凝乳酶添加量为每克酪蛋白添加120U凝乳酶，木瓜蛋白酶的添加量为每克酪蛋白添加3000U木瓜蛋白酶；

且，三个酶解组酶解处理前均将酪蛋白在37℃预热0.5h。

5.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述三个酶解组酶解温度均为37℃，且酶解过程中用1mol/L HCl或1mol/LNaOH稳定pH值在6.0。

6.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述离心条件为4℃下，8000rpm离心15min，且离心后的上清液调节pH至8.0后再行冻干。

7.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述多肽溶液的浓度为20mg/ml。

8.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，步骤(2)超滤离心时，依次用含10kDa和3kDa超滤膜的超滤离心管离心，离心参数为4℃下，6000rpm离心50min。

9.根据权利要求3所述牦牛乳酪蛋白DPP-IV抑制肽的筛选方法，其特征在于，所述(4)潜能DPP-IV抑制肽识别步骤仅对10肽及以下片段进行分析。