[发明专利]一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法，属于动物细胞培养技术领域。本申请通过特殊的收集、消毒、切割等处理方式获得卵巢颗粒细胞。本申请的方法具有简便、省力、污染率低、卵泡液获得率高等优点，为卵巢颗粒细胞、卵母细胞及卵泡发育的研究打下基础。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法。

背景技术

绵羊卵泡发育是由内分泌调控和外部调控相结合的一个十分复杂有序过程，颗粒细胞和卵母细胞作为卵泡的主要成分，在卵泡募集、选择、优势化、成熟、排卵及黄体形成等各个阶段都发挥着重要作用。了解绵羊卵泡发育过程及调控机制，可以有效提高绵羊排卵率，进一步提高绵羊繁殖效率。

颗粒细胞(granulosa cells，GCs)作为哺乳动物卵巢的主要功能细胞，在卵泡发育过程中发挥至关重要的作用。卵巢颗粒细胞表面存在卵泡刺激素(folliclestimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体，能在促性腺激素的作用下促使颗粒细胞发生增殖并分泌卵泡液，促使卵泡逐渐成熟。颗粒细胞同时能通过间隙连接为卵母细胞提供所需营养调节代谢，对于维持卵母细胞的正常功能起着重要的作用。此外，雄激素、雌激素、促性腺激素、生长激素等激素、EGF、IGF2I、TNF2ɑ等细胞因子及p53、Bcl-2、Fas等基因直接或间接参与或调控颗粒细胞凋亡，从而启动卵泡闭锁，影响卵泡发育。

因此，为了研究卵巢颗粒细胞增殖和凋亡对绵羊卵泡发育的调控机制，颗粒细胞的分离、培养及鉴定就成了首要任务。

目前，绵羊卵巢颗粒细胞分离多采用针头刺破卵泡或注射器吸取卵泡液的方法，虽然操作简便，但仍存在吸液费力、卵泡液浪费等现象；且绵羊卵巢颗粒细胞的分离或培养操作过程中存在细胞污染、细胞传代死亡等现象，鉴定过程存在染色不均、掉片、荧光过重等问题。鉴于此，如何提供一种高收率、低污染、高存活的绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种卵巢颗粒细胞分离方法，步骤如下：

(1)收集新鲜卵巢，消毒后，置于预热生理盐水中，浸泡2-4h；

(2)取出浸泡卵巢，消毒后，用预热生理盐水清洗；

(3)将步骤(2)处理后的卵巢剔除脂肪及系膜，之后用预热生理盐水清洗；

(4)将步骤(3)处理后的卵巢转移至培养基中，将刀片与水平呈30°-60°切割卵巢，释放卵泡液，操作在液面下完成，得离体卵泡液；

优选的，步骤(1)、(2)和(3)中，所述的预热生理盐水为37℃；

优选的，步骤(2)和(3)中，所述清洗的次数为3次；

优选的，步骤(4)中，所述新鲜卵巢为含直径3-7mm卵泡的卵巢；

优选的，步骤(4)中，所述培养基为DMEM/F12培养基；

一种卵巢颗粒细胞的培养方法，步骤如下：

(1)将权利要求1得到的离体卵泡液，离心去上清后，按0.4-1.5×10⁵个/mL细胞密度加入完全培养基，混匀后，置于37℃、5％CO₂条件下培养；

(2)24h换液后继续贴壁培养，每2天更换一次培养基；

(3)当细胞汇合度达70％-90％时进行传代；