[发明专利]一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法

权利要求书

1.一种卵巢颗粒细胞分离方法，其特征在于，步骤如下：

(1)收集新鲜卵巢，消毒后，置于预热生理盐水中，浸泡2-4h；

(2)取出浸泡卵巢，消毒后，用预热生理盐水清洗；

(3)将步骤(2)处理后的卵巢剔除脂肪及系膜，之后用预热生理盐水清洗；

(4)将步骤(3)处理后的卵巢转移至培养基中，将刀片与水平呈30°-60°切割卵巢，释放卵泡液，操作在液面下完成，得离体卵泡液。

2.如权利要求1所述的卵巢颗粒细胞分离方法，其特征在于，步骤(1)、(2)和(3)中，所述的预热生理盐水为37℃。

3.如权利要求1所述的卵巢颗粒细胞分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述新鲜卵巢为含直径3-7mm卵泡的卵巢。

4.如权利要求1所述的卵巢颗粒细胞分离方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养基为DMEM/F12培养基。

5.一种卵巢颗粒细胞的培养方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将权利要求1得到的离体卵泡液，离心去上清后，按0.4-1.5×10⁵个/mL细胞密度加入完全培养基，混匀后，置于37℃、5％CO₂条件下培养；

(2)24h后更换完全培养基，继续贴壁培养，每2天更换一次培养基；

(3)当细胞汇合度达70％-90％时进行传代。

6.如权利要求5所述的卵巢颗粒细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心参数为1500r/min 10min。

7.如权利要求5所述的卵巢颗粒细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述完全培养基为由以下成分配制而成：

DMEM/F1245mL+FBS 5mL+双抗500μL+50μg/mL丙酮酸钠1μL；

所述双抗包括100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

8.一种卵巢颗粒细胞的鉴定方法，其特征在于，步骤如下：

以0.4-1.5×10⁵个/mL的密度接种细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中，当细胞汇合度达70％-90％进行爬片，通过HE染色和FSHR免疫荧光结合鉴定。