[发明专利]一种多方法联用的大片段DNA重组方法

说明书

本发明公开了一种多方法联用的大片段DNA重组方法，包括以下步骤：S确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC；本发明突破了BAC大小限制，原则上最大能到450kb。解决了BAC修饰过程中会引入重组酶位点的问题。提高了整个方案的可操作性，便于进行多个大片段的整合和修饰。

技术领域

本申请涉及DNA重组方法，具体涉及一种多方法联用的大片段DNA重组方法。

背景技术

BAC(细菌人工染色体)是一种细菌染色体克隆载体，常规能容纳100kb的 DNA分子片段，最多能容纳300kb的DNA分子片段。随着科技的进步对于大片段 DNA修饰的需求日益增长，在此介绍一种多方法联用的对BAC进行改造的方法。

目前常用的大片段DNA重组技术有如下几种：

(1)YAC的构建：酵母人工染色体(YAC)的构建，YAC本身优点是容量大，最大能容纳1MB的DNA片段，但是它的缺点同样明显，YAC很容易发生DNA的重组导致最终结果不可控；

(2)常规BAC的构建：细菌人工染色体(BAC)的构建，BAC本身优点是稳定性高、便于改造；但缺点是容量小常规情况下不超过300kb，改造难度大，不能做到多位置无缝修饰。

上述方法虽然各有特色，但都存在不足：

(1)YAC的构建，YAC构建难度大，本身稳定性较差往往拿到的阳性克隆和目标序列有差距，最终导致实验结果不尽如人意。主要原因是YAC是在酵母中进行改造和修饰，很容易受到酵母本身重组酶的影响，同时YAC本身是结合在酵母染色体上，容易发生重组和置换。

(2)常规BAC的构建是依赖于Red重组酶进行的，首先BAC本身大小不会超过300kb，同时BAC本身没有抗性基因筛选导致常规BAC修饰存在容量小和修饰困难的缺点。

发明内容

为了解决上述现有技术的缺点，本发明公开了一种多方法联用的大片段 DNA重组方法，将Red重组技术、RMCE技术、Phes负筛技术连用，可以将BAC 装载容量扩大到450kb左右，并且可以做到任何位点无缝插入。

本发明的技术方案如下：

一种多方法联用的大片段DNA重组方法，包括以下步骤：

确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述方法包括以下步骤：

(1)根据片段需要在BAC上设计抗性片段和重组酶位点；

(2)引物设计；

(3)进行BAC修饰：

(4)RMCE-BAC融合；

(5)Phes负筛进行无缝修饰；

(6)最终BAC提取以及验证。

进一步的，上述一种多方法联用的大片段DNA重组方法，所述步骤(1) 包括以下具体步骤：

1)根据项目需要查找BAC大片段需要拼接的位置；

2)根据确定的位置然后选择插入的重组酶位点；

3)确定好重组酶位点后根据拼接需要确认插入抗性序列；