[发明专利]一种多方法联用的大片段DNA重组方法

权利要求书

1.一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

确认好需要进行拼接修饰的BAC，根据需要将BAC修饰好重组酶位点，再通过RMCE进行拼接，拼接完成的BAC进行下一步的拼接；当三个BAC拼接好后再通过phes负筛将不需要的重组酶位点删去，最终得到无缝拼接的BAC。

2.根据权利要求1所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据片段需要在BAC上设计抗性片段和重组酶位点；

(2)引物设计；

(3)进行BAC修饰：

(4)RMCE-BAC融合；

(5)Phes负筛进行无缝修饰；

(6)最终BAC提取以及验证。

3.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下具体步骤：

1)根据项目需要查找BAC大片段需要拼接的位置；

2)根据确定的位置然后选择插入的重组酶位点；

3)确定好重组酶位点后根据拼接需要确认插入抗性序列；

4)通过RMCE进行融合拼接，将完整的序列拼接出来；

5)通过Phes删除残留的重组酶位点。

4.据权利要求3所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述重组酶位点选自loxP＝SEQ ID NO：1、lox511＝SEQ ID NO：2、lox5171＝SEQ ID NO：3、lox2272＝SEQ ID NO：4、LoxN＝SEQ ID NO：5中的一个或者多个；所述抗性序列选自Kan抗性序列＝SEQ ID NO：6、Amp抗性序列＝SEQ ID NO：7、Spe抗性序列＝SEQ ID NO：8；Zeo-phes序列＝SEQ ID NO：9中的一个或者多个。

5.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(2)引物设计包括以下具体步骤：

1)根据拼接好的文件将引物设计出来；

2)引物设计时需要参照引物设计规则，并且引物需要带有overlap；

3)引物设计规则如下

结合长度	Tm值	GC含量	特异性
20-25bp	45-60	40％-60％	无明显错配

。

6.根据权利要求2所述的一种多方法联用的大片段DNA重组方法，其特征在于，所述步骤(3)进行BAC修饰具体包括以下步骤：

1)通过设计好的引物进行PCR，扩增获得需要的模块；

2)通过Red修饰的方法进行修饰重组酶位点以及筛选抗性；

3)通过菌落PCR确认是否修饰完成；

4)将修饰好的BAC安排BAC提取。