[发明专利]一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法，属于生物工程技术领域。包括以下步骤：(1)将NAMPT生产菌株接种至培养基中进行发酵培养，所述发酵培养条件为：发酵温度32℃‑34℃、溶氧20‑40％、发酵培养时间5‑8h；(2)将发酵体系的温度降至21℃‑23℃，加入IPTG进行诱导培养20‑30h，即生产得到NAMPT。采用本发明的方法可以实现NAMPT的大规模、工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法。

背景技术

尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)是NAD补救合成通路的限速酶，通过合成NAD参与细胞物质和能量代谢、蛋白质修饰、DNA修复等重要过程。对于NAMPT的前期研究主要集中于衰老、免疫应答、炎症反应、糖尿病、氧化应激、代谢方面。近期研究发现NAMPT在恶性肿瘤中表达升高，推测其可能是潜在的治疗靶点之一。NAMPT成为抗肿瘤治疗策略研究热点之一，其生物学功能被不断发掘利用。

因此，NAMPT具有广泛的应用价值，需求量不断增加。但目前还很少见有通过发酵法大规模生产NAMPT的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法。采用本发明的方法可以实现NAMPT的大规模、工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)将NAMPT生产菌株接种至发酵培养基中进行培养，初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20；

(2)将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，同时流加补料，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40％，诱导培养20-30h，即生产得到含有NAMPT酶的发酵液。

优选的，步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：

将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株。

本发明在构建NAMPT生产菌株时，将表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。

优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

优选的，步骤(2)中，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L。

优选的，步骤(2)中，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成。

优选的，步骤(2)中，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％。

本发明的有益效果：

(1)本发明对原核表达NAMPT的生产菌株进行了优化，将表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。