[发明专利]一种单细胞计数的方法及其系统

说明书

本发明的方法以荧光标记的单细胞为检测对象，基于微流控芯片形成微米级的流道实现类似流式的“液流聚焦”，直接识别单细胞产生的荧光信号并计数，最后根据一定的数学模型得到样本中的细胞浓度。采用微米级的微流控芯片作为样本流道，依托微流控芯片精细的的加工工艺，直接通过缩小中央流道宽高的方式实现样本流聚焦(无需鞘液挤压)，与传统流式细胞仪的液流系统相比液路更简单，更稳定。作为一种高灵敏度，高准确性的细胞定量方法，是一种潜在的计量基准方法，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种单细胞计数的方法及其系统，属于计量科学领域。

背景技术

随着生物科学技术不断取得突破性进展，生命科学研究已逐渐从定性科学发展为精准定量的科学。细胞不仅是生物体的结构和功能的基本单位，也是生物体个体发育和系统发育的基础。因此细胞含量的定量测量技术已广泛应用于临床诊断(如免疫状态监控、血液疾病预后)和基础科学研究(如单细胞测序、肿瘤信号通路传导)等各个领域。

细胞定量测量方法有多种，但多数计数方法的准确性相对较差，其中目前准确度较高的测量方法主要有显微镜计数和流式细胞计数两种。前者将细胞样本均匀分布于细胞计数板后进行显微成像，通过人工计数或软件自动识别的方法统计样本中细胞的浓度。流式细胞计数(结合绝对计数微球)是基于已知含量的微球与待测细胞结合荧光抗体的效率基本一致的原则，通过流式细胞仪计算细胞拷贝数浓度。

显微镜计数是细胞计数的基本方法，也是确定其它计数方法有效性的参考。它将细胞样本均匀分布于细胞计数板上，通过人工计数的方法统计显微图像中单位体积的细胞数量。整个计数过程比较耗时费力，且当检测高浓度样本时，反复稀释以及人工误差都会影响最后计数，造成重复性较差。随着技术发展，使用图像分析软件(如ImageJ等)可自动识别显微成像中的细胞颗粒，即根据图片中细胞的灰度值、面积、形状、颜色等特征，将目的细胞与背景区分开，从而替代人工计数自动统计图片中细胞的数量。但当图像目标和背景色差小，图像质量差或细胞重叠交叉时，细胞分界模糊，通过软件难以准确计数。

流式细胞计数法是主要利用流式细胞仪实现单细胞计数。目前一种被认为准确性较高的方法是在细胞样本中加入绝对计数微球作为内参，通过流式细胞仪识别检测流动中的单个细胞和计数微球，并基于两者与抗体结合效率一致原则，根据已知的微球数量来计算细胞浓度。该方法认可度较高，在临床诊断领域得到较广泛的应用。但作为一种间接计数的方法，在体系中引入了微球这一变量，不仅检测成本显著提高，而且在测量中引入新的不确定度来源。例如当微球保存不当、或未充分混匀时都会影响细胞计数结果。

这两种方法细胞计数的前提是将样本制备成单细胞悬液，显微成像或流式检测时细胞间彼此分离，这是进行单细胞计数的基础。但实际上细胞样本中不可避免的存在少量的黏连和细胞分布不均的情况，因此显微成像中细胞间的交叉重叠容易造成计数结果偏低，定量结果重复性下降；流式检测虽然可以通过流动中的物理剪切力可一定程度上减少细胞多聚体的出现，但细胞或微球形成的二聚体、或冲突事件仍然会少量存在，其定量结果需要修正。并且流式细胞计数法在反应体系中引入绝对定量微球，其与细胞结合抗体的效率可能存在少量差别，在增加检测成本的同时影响定量结果的准确性。

以“微流控芯片”作为流道，使荧光抗体标记的细胞样本以单细胞状态逐个经过芯片中央的检测区并被激光激发产生荧光。通过依次识别每个细胞被发出的荧光信号，对样本中细胞个数进行计数，从而实现对细胞浓度的绝对定量。与前述方法相比，“基于微流控芯片的单细胞计数”方法具有下列显著优势：

1.相对传统流式细胞计数，细胞计数更准确。改进两方面：(1)采用微米级的微流控芯片，显著降低检测区的细胞样本流宽度高度。这一设计不仅增强了荧光检测的信噪比，更保证样本中更多细胞以单细胞状态逐个经过检测区。这是信号采集装置有效鉴别每个细胞颗粒，实现准确定量的关键。(2)建立了修正原始计数值的数学模型，减少“二聚体/冲突事件”对计数结果的影响，使定量结果更准确。