[发明专利]一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的核酸检测方法及应用。本方法通过在PCR上游引物的5’端或者下游引物的3’端修饰前间区序列邻近基序(PAM)序列，以实现可以用基于CRISPR‑Cas12a的方法检测任意核酸片段，即使目的片段中不含PAM序列。所述核酸检测平台可用于鉴定鼻疽诺卡菌，具有检测简单、方便、特异性高的特点。

技术领域

本发明公开了一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas蛋白)组成的CRISPR-Cas系统被认为是古菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR-Cas系统不仅应用于基因编辑，而且成为核酸检测的一种有吸引力的工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。2018年，Chen等人报道了他们的发现，当Cas12a蛋白以序列特异的方式切割双链DNA(dsDNA)时，诱导了强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割。研究人员利用Cas12a蛋白的反式切割活性建立了DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans–Reporter)检测方法，该方法能够检测临床标本中与癌症相关的HPV 16型和18型。然而，Cas12a蛋白反式切割活性的释放依赖于靶标序列上的前间区序列邻近基序(PAM)序列(TTTN)，即只有当其识别到PAM序列时，才能发挥反式切割活性。由于要检测的靶标序列不一定含有合适的PAM序列，这因此限制了CRISPR-Cas12a在核酸检测中的应用。

诺卡菌病是由诺卡菌属细菌引起的一种疾病，通常包括急性或慢性肺部感染。诺卡菌病通常是由吸入或皮肤黏膜损伤感染诺卡菌而造成的，是一种罕见的感染，严重者可能危及生命。诺卡菌病的症状与肺结核相似，如发烧、咳嗽和胸痛。鼻疽诺卡菌(Nocardiafarcinica,N.farcinica)是引起诺卡菌病最常见的病原之一，其与分枝杆菌在形态学上极为相似，容易混淆，从而导致误诊。对于许多诺卡菌病患者来说，误诊或可导致疾病的延误和错误治疗，从而提高了病死率。此外，诺卡菌暂无合适的选择性培养基，因此分离培养所需时间长(2～14天)，易造成延误治疗。基于现有技术存在的问题，本技术领域迫切需要一种充分应用CRISPR-Cas12a技术，能够简便、快速、准确地检测核酸标本的方法，进而需要一种应用该方法原理检测鼻疽诺卡菌核酸的方法。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的就是建立一种新的基于CRISPR-Cas12a的核酸检测方法，命名为CRISPR-Pa(CRISPR/Cas12a combined PCR amplification)。该方法将聚合酶链扩增反应(PCR)与CRISPR-Cas12a检测相结合，通过在聚合酶链扩增反应的上游扩增引物5’端或者下游引物的3’端修饰PAM序列(TTTA)，并在其上添加一个A碱基对PAM序列进行保护，以实现可以检测任意序列的目的。CRISPR-Pa作为一种新的核酸检测方法，将能够广泛应用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增和检测。

基于上述目的，本发明首先提供了一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤

(1)以样本中的核酸作为模板进行聚合酶链扩增反应，其中，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的5’端或者下游引物的3’端加入了PAM位点的修饰；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增反应产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述的PAM位点的修饰序列如SEQ ID NO.1所示。