[发明专利]一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤

（1）以样本中的核酸作为模板进行聚合酶链扩增反应，其中，所述聚合酶链扩增反应上游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列如SEQ IDNO. 3所示，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的5’端加入了PAM位点的修饰，所述PAM位点修饰的序列如SEQ ID NO. 1所示；

（2）使用步骤（1）获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.4；

（3）对步骤（2）的反应体系进行荧光强度的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚合酶链扩增反应的退火温度为61-73℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述聚合酶链扩增反应的退火温度为69℃。

4.一种基于CRISPR-Cas12a技术的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于聚合酶链扩增反应的上游引物，用于聚合酶链扩增反应的下游引物，其中，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列由SEQ ID NO. 2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列由SEQID NO. 3所示，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO. 4所示，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO. 5所示，在所述上游引物的5’端加入了PAM位点的修饰，所述的PAM位点的修饰序列如SEQ ID NO. 1所示。