[发明专利]一种蛋白酶K高表达工程菌株的构建及应用

说明书

本发明公开了一种蛋白酶K高表达工程菌株的构建及应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明提供了一种新的编码蛋白酶K的基因，将该基因连接在pPICZαA表达载体上，构建蛋白酶K的单拷贝重组载体pPICZαA‑PRK，并基于同尾酶法，构建体外串联重复表达盒式结构多拷贝表达载体pPICZαA‑PRK‑nC；再通过酪蛋白透明圈法，筛选透明圈较大即潜在高表达量菌株，再通过摇瓶甲醇诱导表达筛选出表达量最高的菌株。相对于通过抗生素压力的筛选方法相比，本发明的构建方法和筛选方法不仅环保，而且能极大缩短筛选时间并节省人力成本。

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶K高表达工程菌株的构建及应用，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，底物谱非常广泛且具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶K不仅可用于生化实验中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交中，蛋白酶K具有降解包围靶DNA蛋白质的作用，可以用来处理杂交前的样本，提高检测的敏感性，还可以用于IVD生化检测试剂和分子诊断试剂中。

早期商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶K的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。近年来，酵母表达系统被广泛用于各种外源蛋白质的表达，并获得了较高的蛋白表达水平。影响酵母表达水平的因素很多，如外源蛋白的特性、外源基因的拷贝数、外源基因整合的位置、外源蛋白的糖基化程度、发酵条件等，其中最易干预的是外源基因的拷贝数和发酵条件。提高目的基因在酵母表达宿主的整合拷贝数是提高单个酵母细胞中目的蛋白表达量的最为有效的方法。

筛选高拷贝菌株通常有2种方法：1)利用整合质粒自带的抗性标记进行筛选，但通常情况下抗生素压力筛选出的菌株并未表现出更高的目的蛋白表达量；2)利用限制性内切酶，人工体外构建多拷贝重组质粒，然后电转酵母后再摇瓶诱导筛选表达量提高的菌株，但此筛选方法设备占用率大而且筛选效率低。

通常，构建体外多拷贝表达载体的方法可利用Incitrogen公司开发的pA0815载体，该方法利用表达盒两端同尾酶酶切位点Bgl II和BamH I，酶切纯化表达盒后插入到完整的pA0815载体的BamH I位点以产生串联重复表达盒。但是该方法的缺陷是插入的方向是随机的，如果两个表达盒的方向相反，难以筛选到高表达量的菌株。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一种蛋白酶K高表达工程菌株的构建方法及其快速筛选方法。

本发明提供了一种编码蛋白酶K的基因，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了携带所述基因的表达盒。

在一种实施方式中，所述表达盒含有SEQ ID NO.2所示的序列。

在一种实施方式中，所述表达盒按5’-3’的方向依次含有AOX1启动子，alpha-factor，PRK编码基因和AOX1终止子。

在一种实施方式中，所述表达盒中含有多个AOX1启动子-alpha-factor-PRK编码基因。

在一种实施方式中，所述表达盒按5’-3’的方向依次含有n×(AOX1启动子，alpha-factor，PRK编码基因，AOX1终止子)；其中，n为大于1的整数。

本发明还提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为pPIC系列质粒。

在一种实施方式中，所述表达载体可以是pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα和pPIC9K。

在一种实施方式中，所述表达载体为pPICZαA。