[发明专利]一种蛋白酶K高表达工程菌株的构建及应用

权利要求书

1.一种编码蛋白酶K的基因，其特征在于，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.携带权利要求1所述基因的表达盒。

3.含有权利要求1所述基因或权利要求2所述表达盒的表达载体。

4.表达权利要求1所述基因的重组微生物细胞。

5.一种重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母X33为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的蛋白酶K基因；所述蛋白酶K基因的拷贝数可以为1～7个。

6.构建权利要求5所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤：

(1)构建单拷贝重组载体：将SEQ ID NO.2所示的基因片段两端添加酶切位点和保护碱基片段，再连接至pPICZαA质粒中；

(2)构建多拷贝重组载体：将步骤(1)获得的单拷贝重组载体双酶切，分别获得蛋白酶K基因表达盒和载体片段，将载体片段与多个所述表达盒串联片段连接，获得多拷贝重组载体；

(3)应用甲醇干酪素筛选高表达量菌株：将步骤(2)构建的重组载体转化至毕赤酵母细胞中，获得重组毕赤酵母细胞；再将重组毕赤酵母细胞在甲醇干酪素筛选培养基中培养，根据形成的菌落周围的透明圈筛选高表达量的菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是在SEQ ID NO.2所示的基因序列5’端添加第一酶切位点和保护碱基片段，3’端添加第二酶切位点和保护碱基片段，连接至pPICZαA质粒的EcoR I和Not I之间，得到单拷贝重组载体pPICZαA-PRK。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的甲醇干酪素筛选培养基含有酵母粉8～12g/L，蛋白胨15～25g/L，琼脂粉12～16g/L，牛奶乳酪蛋白8～12g/L；所述培养是将所述重组毕赤酵母细胞接种至甲醇干酪素筛选培养基上，于28～30℃培养一段时间，再每隔20～24h添加适量无水甲醇，共培养48h-60h后观察透明圈大小。

9.一种生产蛋白酶K的方法，其特征在于，将权利要求5所述的重组毕赤酵母发酵，收集发酵液中的蛋白酶K。

10.权利要求5所述重组毕赤酵母或权利要求6～9任一所述方法在生产含蛋白酶K的产品方面的应用。