[发明专利]一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法

说明书

本发明公开了一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法，属于分子生物学技术领域。本发明的试剂盒包含结合液、磁珠悬浮液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液；其中，结合液含Tris‑HCl、氯化钾、异硫氰酸胍、氯化锂，洗涤液A含Tris‑HCl、氯化钾、盐酸胍，洗涤液B含Tris‑HCl、乙醇，洗脱液含Tris‑HCl、EDTA。本发明针对血浆游离DNA含量低、片段化程度高等特点优化了试剂成分，能针对性地高效回收血浆中的游离DNA，提取的DNA浓度和纯度更高，能更好地满足下游检测的要求，提高检测的灵敏度。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

血浆游离DNA，又称血液循环DNA，是指血液中游离于细胞外的DNA，其来源主要有3种：白细胞崩解释放的DNA、坏死组织特别是肿瘤组织释放入血液的DNA和感染病毒、细菌的DNA。近几年来，随着基因诊断技术的发展，游离DNA的应用价值越来越大，如优生筛查、肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染基因检测等。但血液中游离DNA含量一般较低，片段较小，不易提取，这大大影响了游离核酸的基因检测和各种研究的开展。

游离DNA提取方法一般有TRizol方法、离心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取，适合较多样本的高通量处理，但磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。然而离心柱法很实现完全的自动化提取，不适合大量样本的处理，通量受限。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于磁珠的高效血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法。本发明从血浆中提取的游离DNA片段浓度高、纯度高，且能兼容高通量的自动化提取设备，适合高通量的血浆游离DNA提取。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种血浆游离DNA提取试剂盒，包含结合液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液。所述的结合液成分为：20-50mM Tris-HCl、pH 7.0-8.0，50-150mM氯化钾，2-4M异硫氰酸胍，10-30mM氯化锂；所述的洗涤液A成分为：20-30mM Tris-HCl、pH 7.5-8.0，100-200mM氯化钾，2-4M盐酸胍；所述的洗涤液B成分为：20-30mM Tris-HCl、pH 7.0-8.0，75-85％乙醇；所述的洗脱液成分为：20-30mM Tris-HCl、pH 7.5-8.5，1-3mM EDTA。所述的血浆游离DNA提取试剂盒还包含磁珠悬浮液。

优选的，所述的结合液成分为：20mM Tris-HCl、pH 7.8，70mM氯化钾，2.5M异硫氰酸胍，20mM氯化锂；所述的洗涤液A成分为：20mM Tris-HCl、pH 7.8，150mM氯化钾，2.5M盐酸胍；所述的洗涤液B成分为：20mM Tris-HCl、pH 7.8，80％乙醇；所述的洗脱液成分为：20mMTris-HCl、pH8.5，2mM EDTA。

使用上述提取试剂盒提取血浆中游离DNA的方法，其包括如下步骤：

(1)取游离血浆200μL加入离心管中，再加入300-700μL结合液，震荡混匀1分钟；

(2)向上述混合液中加入15-40μL磁珠悬浮液，震荡混匀后，室温静置5-10分钟；

(3)将离心管放在磁力架上，使磁珠吸附，将溶液吸出丢弃；

(4)向离心管中加入500-800μL洗涤液A，震荡混匀1分钟，放在磁力架上，使磁珠吸附，将溶液吸出丢弃；

(5)向离心管中加入500-800μL洗涤液B，震荡混匀1分钟，放在磁力架上，使磁珠吸附，将溶液吸出丢弃；

(6)将离心管开盖放置1分钟，使乙醇完全挥发；