[发明专利]同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法

说明书

本发明公开了一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT‑PCR引物组，引物对TMGMV‑F和TMGMV‑R为检测烟草轻型绿花叶病毒的引物，引物对CFEV1‑F和CFEV1‑R为检测小米椒内源RNA病毒1的引物，引物对PCV2‑F和PCV2‑R为检测辣椒潜隐病毒2的引物；本发明还公开了使用该多重RT‑PCR引物组检测辣椒三种RNA病毒的方法，通过一次RT‑PCR反应来检测植株是否感染上述三种病毒。本发明用三重RT‑PCR检测三种辣椒病毒即烟草轻型绿花叶病毒、小米椒内源RNA病毒1和辣椒潜隐病毒2，与目前单重RT‑PCR和双重RT‑PCR检测方法相比，用一次RT‑PCR反应可检测三种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum)已成为我国第一大的蔬菜产业，其播种面积在蔬菜作物中位居第一，年产值约2500亿元(王立浩等，2019)。长期以来，我国辣椒病毒病发生十分普遍，且有逐年加重的趋势，严重影响辣椒的产量、品质和经济效益(汪沛等，2015；于海龙等，2020)。目前已知侵染辣椒的病毒有60种以上(Kenyon et al.，2014)，仅我国报道的已达33种，大部分为单链RNA(single strand RNA，ssRNA)病毒，少数为单链(single strand DNA，ssDNA)病毒和双链RNA(double strand RNA，dsRNA)病毒(Kenyon et al.，2014；Ruan，2012；Roossinck，2010)。大多数常见的病毒种类如黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)等3大ssRNA病毒属中的病毒已有较多的研究。

烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus，TMGMV)是Tobamovirus成员之一，是该属在辣椒上发生和危害报道较多的病毒之一，主要侵染辣椒外，番茄和茄子等重要茄科蔬菜都是TMGMV的自然寄主。感染TMGMV的辣椒植株表现出叶片畸形、斑驳、花叶和植株矮化等症状，造成辣椒产量下降，品质降低。近年来，随着国内外辣椒品种的引进和交流的发展、栽培制度及气候条件的变化，各地病毒种类也在发生变化。同时，随着病毒检测手段的日益发展，许多新的病毒种类逐渐被发现。

小米椒内源RNA病毒1(Capsicum frutescens endornavirus 1，CFEV 1)是内源RNA病毒科(Endornaviridae)内源RNA病毒属(Endornavirus)的一种ssRNA病毒，在辣椒上还发现另外2种内源RNA病毒即甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)和辣椒内源RNA病毒(Hot pepper endornavirus，HPEV)(Pfeiffer，1998；SafariRoossinck，2018))。今年本研究团队已经在中国广西辣椒上发现CFEV 1，这之前在我国的辣椒上没见报道，为首次发现。与大多数内源RNA病毒相似，CFEV 1侵染寄主后表面上不会引起寄主任何症状，能够和寄主以慢性持久性方式共生。但现在已经从Endornaviridae中也发现一些内源RNA病毒成员能够对寄主产生影响，如内源RNA病毒VfEV可能与蚕豆细胞质雄性不育性有关，HmEV1-670可以减轻致病菌紫纹羽病菌的毒力，水稻寄主的RNA沉默通路能够识别水稻内源病毒OsEV的RNA，沉默途径中的关键酶OsDCL2的缺失可以影响OsEV的传播和维持。这些报道从深层次说明了此类病毒与寄主之间存在相互作用，并可以在寄主体内产生一定的影响。