[发明专利]一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用

说明书

本发明涉及一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用，本发明提出的GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液，是在M16培养液中添加Nampt激活剂P7C3，所述Nampt激活剂P7C3的添加浓度为0.1‑10µM。本发明同时提出一种改善GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的方法。本发明提出的培养液能满足GV期冷冻卵母细胞体外成熟过程中对能量的需求，进而提高卵母细胞内在质量，且其非整倍体比例与新鲜卵母细胞相比无明显差异。

技术领域

本发明涉及繁殖技术领域，具体涉及一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用。

技术背景

卵母细胞冷冻技术是重要的生殖生物学技术，广泛应用于种质资源保存、生育力保存及辅助生殖技术中。卵母细胞的发育过程分为多期，其中卵原细胞成为初级卵母细胞之后，经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期，在双线期后期，卵母细胞的核很大，染色质高度疏松，外包完整的核膜，此时的卵母细胞称为GV期卵母细胞。GV期卵母细胞冷冻与体外成熟技术相结合可为辅助生殖技术和实验研究扩展卵母细胞来源，在生育力保存及濒危动物保护中具有重要应用价值。

研究发现对GV期卵母细胞进行冷冻保存时可能会损伤卵母细胞膜或卵丘细胞，这些细胞与结构能通过间隙连接影响卵母细胞的成熟过程，GV期卵母细胞周围存在的多层紧密卵丘细胞可能会改变脱水的速度和程度，进而可能加剧细胞质损伤的程度，影响解冻后卵母细胞的内在质量。现有技术主要关注GV期卵母细胞的冷冻过程，如中国专利201510528179.2《一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法》中，为了解决现有卵母细胞冷冻保存解冻后卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率低的问题，提供一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法，卵母细胞冷冻采用cryoloop为载体，以常规培养液为基质，以DMSO和乙二醇为冷冻保护剂，冷冻、解冻过程中添加维生素B12和叶酸，有效提高解冻后卵母细胞存活率及卵母细胞经体外受精和孤雌激活后的胚胎发育率。

虽然冷冻GV期卵母细胞可以产生后代，但解冻后的GV期卵母细胞体外成熟培养发育的质量并不高。提高冷冻卵母细胞体外成熟培养质量已成为促进未成熟卵母细胞冷冻技术有效应用的决定因素。但目前，市场上常用的培养为商业化的M2和M16培养液，没有针对改善GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的专用培养液及相应方法。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提出一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用。

本发明提出的GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液，是在M16培养液中添加Nampt激活剂P7C3，所述Nampt激活剂P7C3的添加浓度为0.1-10μM。

本发明同时提出一种改善GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的方法，包括如下步骤：

S1、采集GV期卵母细胞并置于M2液滴中备用；

S2、将卵母细胞转移至平衡液中30秒，随后转移至玻璃化冷冻液中20-30秒，然后迅速将卵母细胞置于载杆前端，投入液氮；

S3、解冻时，将S2所述载杆迅速从液氮中取出，置于含0.5M蔗糖的PBS中作用5min，然后用M2液清洗三遍后备用；

S4、将S3获得的卵母细胞放入GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液中，覆盖上石蜡油于培养箱中进行体外成熟培养。

优选地，所述Nampt激活剂P7C3的添加浓度为1μM。

优选地，所述步骤S2中，卵母细胞从进入玻璃化冷冻液开始到投入液氮的时间控制在25秒内。

优选地，所述平衡液为含10％DMSO和10％EG的PBS液。

优选地，所述玻璃化冷冻液为含15％EG、15％DMSO、0.5M蔗糖、30％Ficoll的PBS液。

本发明的有益效果如下：