[发明专利]实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一组实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT‑PCR引物探针组，包括猪流行性腹泻病毒M基因的上游引物、下游引物和特异性荧光探针；猪传染性胃肠炎病毒S基因的上游引物、下游引物和特异性荧光探针；猪轮状病毒VP6基因的上游引物、下游引物和特异性荧光探针；猪丁型冠状病毒M基因的上游引物、下游引物和特异性荧光探针。在该引物探针组基础上组装的试剂盒，具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，为一线猪场临床腹泻病毒病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品。

技术领域

本发明涉及实时荧光RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组与试剂盒，以及试剂盒的检测方法。

背景技术

病毒性腹泻是严重危害养猪业的一类疫病，其中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)是4种主要病原。由于PEDV、PDCoV、TGEV和PoRV所致疫病在临床症状上相似，而且经常存在混合感染、继发感染的问题，故增加了猪群的发病率和死亡率，严重危害养猪业的健康发展，进一步加强病原监测，做好疫苗免疫、饲养管理、生物安全等综合防控，是持续降低猪群病毒性腹泻的有效途径。

常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷，尤其是多种病毒感染时，难以有效进行早期检测，容易产生误判错判。特别是当猪腹泻病毒混合感染的现象严重时，检测更需要一个准确有效的方法来区分不同病毒。普通RT-PCR检测以其简单高效等优点被广泛使用，多重RT-PCR在减少工作量的基础上，一次加样检测多种病毒能大大减小实验加样带来的污染。但现有的多重普通RT-PCR检测灵敏度都在10⁴～10³copies左右，这种灵敏度不能满足低拷贝病毒量的早期检测，因此在保证实验特异性、灵敏性和重复性的基础上探索建立一套针对上述四种猪腹泻病毒的多重荧光定量RT-PCR检测方法，有助于提升病毒检测水平，在腹泻疾病诊断、防治及食品安全等方面具有重要的应用前景。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明设计了一组四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组，利用该引物探针组对猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒进行多重荧光定量检测，具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，为一线猪场临床腹泻病毒病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品。

为实现上述目的，本发明提供了一组实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组，包括猪流行性腹泻病毒M基因的上游引物PEDV-F、下游引物PEDV-R和猪流行性腹泻病毒特异性荧光探针PEDV-P；猪传染性胃肠炎病毒S基因的上游引物TGEV-F、下游引物TGEV-R和猪传染性胃肠炎病毒特异性荧光探针TGEV-P；猪轮状病毒VP6基因的上游引物PoRV-F、下游引物PoRV-R和猪轮状病毒特异性荧光探针PoRV-P；猪丁型冠状病毒M基因的上游引物PDCoV-F、下游引物PDCoV-R和猪丁型冠状病毒特异性荧光探针PDCoV-P；

上游引物PEDV-F:5’-CGGTTYTATTCCCGTTGA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游引物PEDV-R：5’-GACACCATACAAGAACRCAG-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

猪流行性腹泻病毒特异性荧光探针PEDV-P：FAM-5’-AACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATA-3’-BHQ1，其为SEQ ID NO:3序列，其中5’端标记有FAM荧光报告基因，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基因；

上游引物TGEV-F：5’-GCATATTACCACAATTTGC-3’，其为SEQ ID NO:4序列；

下游引物TGEV-R：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’，其为SEQ ID NO:5序列；