[发明专利]实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组、试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一组实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组，其特征在于：包括猪流行性腹泻病毒M基因的上游引物PEDV-F、下游引物PEDV-R和猪流行性腹泻病毒特异性荧光探针PEDV-P；猪传染性胃肠炎病毒S基因的上游引物TGEV-F、下游引物TGEV-R和猪传染性胃肠炎病毒特异性荧光探针TGEV-P；猪轮状病毒VP6基因的上游引物PoRV-F、下游引物PoRV-R和猪轮状病毒特异性荧光探针PoRV-P；猪丁型冠状病毒M基因的上游引物PDCoV-F、下游引物PDCoV-R和猪丁型冠状病毒特异性荧光探针PDCoV-P；

所述PEDV-F的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述PEDV-R的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述PEDV-P的序列如SEQ ID NO:3所示，其中5’端标记有FAM荧光报告基因，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基因；

所述TGEV-F的序列如SEQ ID NO:4所示；

所述TGEV-R的序列如SEQ ID NO:5所示；

所述TGEV-P的序列如SEQ ID NO:6所示，其中5’端标记有HEX荧光报告基因，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基因；

所述PoRV-F的序列如SEQ ID NO:7所示；

所述PoRV-R的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述PoRV-P的序列PoRV-P如SEQ ID NO:9所示，其中5’端标记有Cy5荧光报告基因，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基因；

所述PDCoV-F的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述PDCoV-R的序列如SEQ ID NO:11所示；

所述PDCoV-P的序列如SEQ ID NO:12所示，其中5’端标记有ROX荧光报告基因，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基因。

2.一种实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物探针组、荧光RT-PCR反应液和阳性对照标准品。

3.根据权利要求2所述的实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照标准品包括PEDV标准品、TGEV标准品、PoRV标准品和PDCoV标准品；

所述PEDV标准品为克隆有猪流行性腹泻病毒的克隆质粒pUC-57-PEDV，所述TGEV标准品为克隆有猪传染性胃肠炎病毒的克隆质粒pUC-57-TGEV，所述PoRV标准品为克隆有猪轮状病毒的克隆质粒pUC-57-PoRV，所述PDCoV标准品为克隆有猪丁型冠状病毒的克隆质粒pUC-57-PDCoV。

4.一种实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于，采用如权利要求2或3所述多重RT-PCR试剂盒用于荧光定量检测；

25μL的RT-PCR反应体系包括：四种猪腹泻病毒的上、下游引物各0.75μL，使用终浓度均为0.3μM；四种猪腹泻病毒的特异性探针各0.5μL，使用终浓度均为0.2μM；

检测方法中RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，收集荧光信号，共40个循环，结束反应。

5.根据权利要求4所述的实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，检测结果判定有效的条件为：

阴性对照FAM通道检测无Ct值，阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；

阴性对照HEX通道检测无Ct值，阳性对照HEX通道检测Ct值≤30；

阴性对照Cy5通道检测无Ct值，阳性对照Cy5通道检测Ct值≤30；

阴性对照ROX通道检测无Ct值，阳性对照ROX通道检测Ct值≤30。

6.根据权利要求5所述的实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，检测结果的判定标准为：

FAM通道检测Ct值≤40，判定样品为猪流行性腹泻病毒核酸阳性；FAM通道检测无Ct值，判定样品为猪流行性腹泻病毒核酸阴性；

HEX通道检测Ct值≤40，判定样品为猪传染性胃肠炎病毒核酸阳性；HEX通道检测无Ct值，判定样品为猪传染性胃肠炎病毒核酸阴性；

Cy5通道检测Ct值≤40，判定样品为猪轮状病毒核酸阳性；Cy5通道检测无Ct值，判定样品为猪轮状病毒核酸阴性；

ROX通道检测Ct值≤40，判定样品为猪丁型冠状病毒核酸阳性；ROX通道检测无Ct值，判定样品为猪丁型冠状病毒核酸阴性；

两个或两个以上通道检测Ct值，判定样品为混合感染；四个通道检测均无Ct值，判定样品为四种猪腹泻病毒核酸阴性。