[发明专利]一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒、制备方法及应用

说明书

本发明构建了一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒，本发明利用基因工程技术，设计HDAC10启动子的引物，以大鼠基因组为模板进行PCR扩增得到的目的片段，将其与pGL3‑basic载体双酶切后再连接，经酶切鉴定并测序后，得到pGL3‑HDAC10重组质粒，构建H9c2细胞的氧糖剥夺模型后，将本发明构建的pGL3‑HDAC10重组质粒转染到H9c2细胞中，通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反映HDAC10基因启动子活性在不同缺氧时间下的变化情况，用于筛选抗缺氧损伤药物，该方法具有靶向性强、灵敏度高、检测速度快的特点。

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒、制备方法及应用。

背景技术

缺氧(hypoxia)是指因组织用氧障碍或氧气供应不足而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧时间过长会给机体造成严重的损害，导致细胞凋亡，引起癌症、慢性炎症、心肌梗死、心绞痛、卒中和缺血性急性肾损伤等一些疾病的产生，最终可引起人体心、脑、肝等重要脏器由于能量供应不足而死亡。

急性心肌梗死(AMI)在世界范围内导致高发病率和高死亡率是最严重的心血管疾病之一，缺氧发生在急性冠状动脉阻塞中，并导致心肌细胞死亡，是AMI的第一阶段。在原发性血管成形术中会发生完全的缺氧/复氧，是一个有害事件，缺氧/复氧(H/R)诱导局部心肌细胞凋亡，导致心肌产生不可逆的损伤。

HDACs抑制剂在心肌缺血/再灌注损伤中通过抑制未成熟血管的产生、减少炎症或促进能量代谢来介导对心肌的保护作用，被认为是减少I/R损伤、改善心脏功能障碍和减少梗死大小的有效药物。研究发现，HDACs参与一系列心脏和血管的事件，包括心肌细胞的胚胎发生、生长发育、凋亡，缺血心肌的修复，血管内皮的分化、抗凝、纤溶，血管平滑肌细胞的迁移和增殖，心脏氧化应激、炎症细胞募集等。在AMI、心力衰竭、心脏肥大、动脉粥样硬化、先天性心脏病如室间隔缺损和薄壁心肌等疾病模型中，都报道检测到某些特定的HDAC的表达水平较基线水平有较为明显的升高或降低。HDAC10在HDACs家族中属于IIb类，位于细胞质和细胞核中，可作为转录调节剂。有研究发现，HDAC10与血管新生抑制因子PEDF在蛋白表达上显著负相关， HDAC10通过其去乙酰化酶活性，参与介导了MI大鼠心肌组织中PEDF的基因沉默，从而导致心肌细胞死亡和心功能障碍，与心肌细胞缺氧损伤密切相关。

HDAC10表达受启动子区域的调控。因此，针对HDAC10基因启动子设计相应的筛选和检测方法很有必要，这对进一步研究HDAC10调控心肌细胞缺氧损伤的作用有重要意义。本发明人利用基因重组技术，采用PCR的方法，从大鼠基因组中扩增出了1613bp的HDAC10启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体上。将荧光素酶报告基因的重组质粒转染到H9c2细胞中，成功构建了HDAC10启动子细胞模型，研究不同缺氧时间对HDAC10启动子表达的影响,后续可用于抗缺氧损伤药物的筛选。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒及制备方法。

技术方案

一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒：以含双荧光素酶报告基因(萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶)的pGL3-basic质粒为载体，在pGL3-basic质粒的KpnI和MluI 的限制性酶切位点之间，插入HDAC10基因启动子序列，得到含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒；所述HDAC10基因启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述pGL3-basic质粒为pGL3-basic质粒4818bp。

上述含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：