[发明专利]一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，包括步骤：(1)两亲株的获得；(2)两亲株原生质体制备；(3)两亲株原生质体灭活；(4)原生质体融合；(5)初筛、复筛及遗传稳定性测定。本发明利用原生质体融合的方法，成功筛选出一株提高抗菌肽产量的菌株fusB‑116。与原始菌株相比，经过改良的菌株fusB‑116产生抗菌肽的能力显著提高。与现有技术相比，本发明采用递进式原生质体融合技术，对出发菌株进行不断改良，其操作简单快速，效果显著，具有较好的应用推广前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及菌株的培养和选育，具体是一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌活性物质具有强大的抗菌作用，同时它们又不会破坏动物体内的正常细胞，对人体组织来说绿色安全，而且具有“传统抗生素”无法比拟的优越性，它们是真正的广谱抗菌剂。尤其伊枯草菌素(Iturins)家族中的杆菌霉素D(Bacillomycin D)是目前唯一的一种从微生物中提取对黄曲霉具有良好抑制作用的天然活性物质。因而抗菌脂肽在食品、生物医药、农业等领域有重要的应用前景。目前国内发酵工业中微生物菌株分泌抗菌脂肽的产量普遍较低，满足不了批量化生产的要求。本实验室保藏的一株枯草芽孢杆菌，主要产抗菌肽类型为杆菌霉素D，但其产量比较低。因此筛选抗菌肽高产菌株来提高脂肽产量，对于今后工业化生产具有重要的应用价值。

培养和选育抗菌脂肽高产微生物菌株在工业化生产中占据非常重要的地位，需要人为利用一些技术手段对该野生型枯草芽孢杆菌株进行育种改造，进而提高菌株产抗菌脂肽的量以满足工业化生产需求。原生质体融合是20世纪60年代应用于动植物及微生物育种而产生的一门技术，是指细胞在破壁酶的作用下除去细胞壁形成的原生质体，利用特定物质诱导两个及以上亲本原生质体相互融合且发生基因重组，并在合适培养基的条件下重新长出细胞壁而获得融合子的过程。该方法可以提高遗传物质重组频率，应用范围广且便于开展工作。自原生质体融合技术诞生以来，已经广泛运用于微生物育种中并以此获得大量有应用价值的融合菌株。如王怡平等人利用两株不同菌种假单胞菌进行原生质体融合，获得的融合菌株(融合子)对硫化物等物质的耐受能力较双亲本菌株有显著提高。Jin等人以多株高产多杀菌素产生菌为原始菌株，通过原生质体融合选育出一株产多杀菌素的量较原始菌株提高了两倍。但是在提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量方面，还没有采用原生质体融合获得优良微生物的报道，因此，亟需提供一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法。

发明内容

本发明的目的是要现有技术中存在的不足，提供一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，筛选出高产抗菌脂肽菌株。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；

S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10-30min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.05-0.4mg/mL；