[发明专利]一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法

权利要求书

1.一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、两亲株的获得：将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的枯草芽孢杆菌菌株B-01培养至对数后期，取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经等离子及化学复合诱变后，筛选获得抗弧菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-23；另取枯草芽孢杆菌菌株B-01的菌液经紫外及化学复合诱变后，筛选获得抗霉菌能力较强的枯草芽孢杆菌mutB-36；以枯草芽孢杆菌mutB-23和枯草芽孢杆菌mutB-36作为出发菌株，分别将它们培养至对数后期，获得枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液；

S2、两亲株原生质体制备：分别向枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中加入溶菌酶，于37℃酶解10-30min，获得枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液；枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.05-0.4mg/mL；

S3、两亲株原生质体融合：分别将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液进行灭活；然后取等量灭活的枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液和枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液混合5min，离心收集菌体；在收集的菌体中加入0.01-0.02mol/L的CaCl₂溶液混合菌体，再加入pH值为7-9、浓度为30-50％的PEG6000于37℃融合10-20min，收集菌体并洗涤，涂布于再生培养基平板上培养24h，即得融合子；

S4、初筛、复筛及遗传稳定性测定：挑取适量融合子菌体接种于发酵培养基培养48h，离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，初步筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；将初筛效果较优菌株逐级活化后，接种至发酵液体培养基中发酵48h；离心得到发酵上清液；利用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为指示菌，复筛选出抑菌圈直径较大的菌株fusB-101、fusB-116、fusB-132和fusB-156；复筛后的每个菌株再分别传代培养，检查其抑菌活性大小，共传代九次，最后挑选出抑菌活性高、而且遗传性能稳定的高产融合菌株fusB-116。

2.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中培养至对数后期的时间为12-13h。

3.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中，枯草芽孢杆菌mutB-23菌液和枯草芽孢杆菌mutB-36菌液中溶菌酶添加量分别为0.2mg/mL，酶解时间为25min。

4.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中灭活具体方法为：将枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液在100℃处理10-50min进行灭活；将枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液置于15w的紫外灯管下20cm处，紫外照射10-100min进行灭活。

5.根据权利要求4所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌mutB-23原生质体溶液灭活的时间为40min，枯草芽孢杆菌mutB-36原生质体溶液灭活的时间为80min。

6.根据权利要求1所述的选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S3中，在收集的菌体中加入0.01mol/L的CaCl₂溶液混合菌体，再加入pH值为9、浓度为40％的PEG6000于37℃融合15min。