[发明专利]SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ病毒样颗粒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种SFV‑helper质粒，其是通过构建如SEQ ID NO.1所示的重组载体，并合成如SEQ ID NO.2所示的插入片段基因，再将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。相应的，本发明还提供一种pSFVCs‑LacZ病毒样颗粒及其制备方法，包括：(1)构建所述SFV‑helper质粒；(2)将pSFVCs‑LacZ、SFV‑helper质粒体外转录成mRNA，然后将mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFVCs‑LacZ病毒样颗粒。相应的，本发明还提供SFV‑helper质粒、pSFVCs‑LacZ病毒样颗粒的应用。实施本发明，能高效表达β‑半乳糖苷酶，并具有较好的生物安全性。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ 病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

糖香酶，亦称糖香水解酶，是一大类可水解糖香键的酶类的总称，可用于寡糖的合成，还可用于炫基糖香以及芳香基糖香的合成，在催化氨基酸、多肽、生物碱和抗生素等物质的糖基化方面也起到重要的作用，在医药和食品领域具有广泛的应用。β-半乳糖香酶是一类重要的糖香酶，由Lacz基因编码的β-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、动物和植物中。

RNA复制子是衍生于RNA病毒基因组并能自主复制的RNA。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(Alphavirus),如辛德比斯病毒 (Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus,VEE)；除甲病毒外，还有黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯状病毒等。被改造用于RNA复制子的表达载体本文以甲病毒(塞姆利基森林病毒)载体为例，阐明RNA复制子疫苗的基本原理和特点。甲病毒是一类正链RNA病毒(75)，基因组长约11-12kb，5’端有帽子结构，3’有多聚腺苷酸结构，有两个开放阅读框，可以编码4个非结构蛋白(NS1，NS2，NS3，NS4)和5个结构蛋白(Core，E3，E2，6K， E1)。甲病毒基因组中位于NS3和NS4间存在一个终止密码子，有时候密码子通读时会产生一个更大的多聚蛋白P1234。但是在某些甲病毒基因组中，如 SINV和O’n yong-nyong virus(ONNV)，此终止密码子被Arg或Cys密码子替换，因此不能产生P123多聚蛋白。而这一现象很有可能是一种潜在的发病机制。多聚蛋白P1234在NS2蛋白的水解作用下，自切割产生P123和NS4 蛋白。同时，P123和NS4蛋白可以作为病毒复制酶，以基因组RNA为模板合成负链RNA。此后，负链RNA亦可以作为模板合成正链的基因组RNA和亚基因组RNA(subgenomic RNA)。随后，P123多聚蛋白被水解产生NS1和P23蛋白，导致负链RNA合成减少，而正链基因组RNA合成增多。P23多聚蛋白的半衰期极短，仅为数秒，而后被水解形成NS2和NS3蛋白。此时，以单体形式存在的NS1、NS2、NS3、NS4蛋白结合形成复制复合体，进一步促进病毒基因组和亚基因组RNA的复制。

本发明以塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)为载体，它包括两个独立的RNA分子,一个RNA分子是包含插入了RNA复制子载体。另一个 RNA分子是辅助RNA。如何利用塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV) 为载体构建一种包装体系，使其能够高效表达β-半乳糖苷酶，对β-半乳糖香酶在食品领域的应用具有重大的意义。然而，如何利用塞姆利基森林病毒进行高效表达β-半乳糖苷酶，目前尚未文献记载。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，其以塞姆利基森林病毒为载体，提供一种SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ病毒样颗粒及其制备方法，能高效表达β-半乳糖苷酶。

本发明还要解决的技术问题还在于，提供SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ 病毒样颗粒的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种pSFVCs-LacZ病毒样颗粒的制备方法，包括：