[发明专利]一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法

说明书

本发明公开了一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，结合细胞模型和3D表皮模型检测结果，将待测物作用于所建立的致敏模型中，筛选能够抑制或促进目标分子表达的物质，从而对产品的致敏安全性进行评价，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品的致敏性提供快捷可靠的评价方法，为原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发及功效验证的进一步研究提供有效依据。

技术领域

本发明涉及一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，属于化妆品技术领域。

背景技术

过敏是指人体免疫系统对某些物质如细菌、病毒、花粉、尘螨、皮毛以及药物等排斥，引起人体的异常反应。过敏性物质(即过敏原，也叫变应原)进入人体后，能使某些组织细胞释放出一些活性物质，而这些活性物质能使平滑肌收缩，毛细血管通透性增加，黏膜腺体分泌增多，所以过敏者常出现表皮红肿、瘙痒、斑块或喉部、支气管、胃肠痉挛等症状。过敏反应是指人体对抗原物质接触后的不正常反应。表皮敏感的一般表现是干燥、瘙痒、红肿、色素沉着等。它于正常的免疫反应不同，不但不起保护作用，相反由于反应过度强烈而导致生理功能紊乱和组织损伤。

表皮致敏的诱导阶段，朗格汉斯细胞起着呈递和修饰抗原、启动免疫反应的作用。当朗格汉斯细胞捕获抗原后，分化、成熟和迁移至局部淋巴结，将抗原传递给 T细胞，促发T细胞的增值。在这个过程中，朗格汉斯细胞活化成熟，表现为共刺激分子(CD86和CD54)表达上调。细胞表面标志CD86、CD54能够在诱导后的 THP-1细胞中检测到。

传统的表皮敏感性预测主要是基于动物实验，包括豚鼠最大值测试、局部封闭涂皮试验以及动物局部淋巴结试验，但一方面由于动物实验成本较高、通量低难以满足化妆品行业飞速发展的需求，另一方面由于动物福利观念的增强和动物实验本身的外推不确定性，基于非动物的体外替代方法越来越多地用于化妆品安全性评价。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，建立体外表皮细胞联合3D表皮共培养致敏模型，将待测物作用于所建立的模型上，筛选能够抑制或促进目标分子表达的物质，结合体外细胞模型和3D表皮模型检测结果，对目标产品的致敏性进行安全评价。

实现上述目的的技术方案是：一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，包括以下步骤：

步骤S1，THP-1细胞培养和3D表皮培养；

步骤S2，THP-1细胞及3D表皮活力检测确定实验样品的检测浓度，包括以下工序：

步骤S21，取步骤S1中生长状态稳定的3D表皮模型，加入实验样品，所述实验样品为待测化妆品原液，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18-24h 后，用MTT检测3D表皮模型的组织存活率；

步骤S22，根据步骤S21筛选得到组织存活率大于50％时对应的实验样品的浓度为3D表皮模型给药浓度；

步骤S3，细胞铺板及表皮模型联合培养步骤：取步骤S1中对数生长的THP-1 细胞接种至6孔细胞培养板，分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入肉桂醛，待测物处理组加入待测物质；同时将3D表皮模型放置在6孔细胞培养板的板内的THP-1细胞上方，放置过程中不要产生气泡；然后将空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质一一对应涂抹在空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组的3D表皮模型上，用量100-200μL，

步骤S4，受试物暴露步骤：然后将步骤S3中的6孔细胞培养板转移至37℃、 5％CO₂、相对湿度95％的CO₂培养箱内，培养时间18-24h；