[发明专利]一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法

权利要求书

1.一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1，THP-1细胞培养和3D表皮培养；

步骤S2，THP-1细胞及3D表皮活力检测确定实验样品的检测浓度，包括以下工序：

步骤S21，取步骤S1中生长状态稳定的3D表皮模型，加入实验样品，所述实验样品为待测化妆品原液，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18-24h后，用MTT检测3D表皮模型的组织存活率；

步骤S22，根据步骤S21筛选得到组织存活率大于50％时对应的实验样品的浓度为3D表皮模型给药浓度；

步骤S3，细胞铺板及表皮模型联合培养步骤：取步骤S1中对数生长的THP-1细胞接种至6孔细胞培养板，分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入肉桂醛，待测物处理组加入待测物质；同时将3D表皮模型放置在6孔细胞培养板的板内的THP-1细胞上方，放置过程中不要产生气泡；然后将空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质一一对应涂抹在空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组的3D表皮模型上，用量100-200μL，

步骤S4，受试物暴露步骤：然后将步骤S3中的6孔细胞培养板转移至37℃、5％CO2、相对湿度95％的CO2培养箱内，培养时间18-24h；

步骤S5，冲洗步骤：取出6孔细胞培养板，用PBS将3D表皮模型表面的空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质冲洗掉；

步骤S6，MTT组织活性检测步骤，具体包括以下步骤：

S61，表皮模型MTT处理步骤：将步骤S5中经过冲洗的3D表皮模型从6孔细胞培养板中取出，取一块24孔细胞培养板，放入200μL的1mg/mL MTT工作液中，将3D表皮模型转移至24孔细胞培养板上，并放入37℃，5％CO2，相对湿度95％的CO2培养箱内，培养时间2-3h；

S62，表皮模型活力检测步骤：取一块新的24孔板，先在孔内加入500-1000μl异丙醇，将步骤S6处理后的3D表皮模型转移到该24孔板内，放置过程中不要产生气泡，在3D表皮模型内加入500-1000μL异丙醇萃取，用封口膜将24孔板覆盖封住，封一层后，盖上盖子再封一层，将24孔板避光过夜；24孔板取出后在摇床上混匀1-2h；将溶液混匀，酶标板空白孔为异丙醇，甲瓒萃取液200μL/每孔，6个复孔，用酶标仪570nm进行检测；取组织存活率大于50％的3D表皮模型进行后续的细胞致敏性实验测试；

步骤S7，体外细胞致敏模型建立步骤，具体包括以下步骤：

步骤S71，THP-1细胞收集步骤，将步骤S5中经过冲洗的3D表皮模型从6孔细胞培养板中取出后，将空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组对应的THP-1细胞，从6孔细胞培养板中分别移入对应的1mL EP管中，离心沉淀THP-1细胞，并用FACS缓冲液清洗一次，再次离心收集THP-1细胞；

步骤S72，FcR阻断步骤：按THP-1细胞数量配制适宜浓度的FcR阻断剂，50-100μL体积的一百万个细胞需要2.5μg的FcR阻断剂，随后将离心获得的THP-1细胞进行阻断；

步骤S73，抗体染色步骤：将进行过阻断的THP-1细胞按每管50μL平均分配至4支1mL的EP管中，在4支1mL的EP管一一对应地加入抗体FITC标记的CD86抗体、PE标记的CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1；4℃环境和暗室条件下染色30min；使用FACS缓冲液清洗2次，再用500μLFACS缓冲液重悬细胞并转移5mL流式管中待检测；每次实验条件下同时进行7-AAD的染色，确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况；

步骤S74，流式细胞测定步骤：收集分析10000个THP-1细胞，通过无处理的空白对照组的THP-1细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次THP-1细胞后续实验的计算结果的准确性，得到细胞表面目标分子表达量，建立以目标分子表达量为基准的体外细胞致敏模型；

步骤S8，结合体外细胞致敏模型，参照步骤S7的方法对待测物质的致敏性进行评价，以目标分子表达量为基准，计算待测物质引起的目标分子相对表达量的变化，以目标分子相对表达量的变化值表示致敏的强度，目标分子相对表达量的变化值越大，待测物质的潜在致敏性越强。